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肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化与肾间质纤维化的关系研究
肾脏疾病发展到一定阶段会引起患者肾间质纤维化,肾间质纤维化与患者病情的严重程度有着密切的联系,而肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化(EMT)与肾间质纤维化具有一定的关系,研究表明肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化受转化生长因子诱导.
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α-平滑肌肌动蛋白在人胚心流出道早期发育中的表达
目的 探讨人胚早期心流出道心肌和流出道心内膜垫内α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达规律及其意义. 方法 32例C10～C16期[Carnegie分期法,受精后(22±1～37)d]人胚心连续切片,经抗α-SMA、抗α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA)、抗肌球蛋白重链(MHC)抗体免疫组织化学染色,观察流出道重塑过程中α-SMA在心肌与心内膜垫内的表达规律. 结果 人胚发育C10～C15期,心包腔背侧脏壁上皮不断分化为心肌细胞添加至流出道远端,这些心肌细胞α-SMA的表达早于α-SCA和MHC.C16期,流出道嵴近心肌处出现α-SMA强阳性细胞,相邻的心肌细胞伸出突起与其相连.C12～C15期,α-SMA阳性细胞逐渐迁入流出道心内膜垫内,同时可见流出道内皮转为α-SMA阳性,向间充质细胞分化.不同来源的间充质细胞共同参与形成螺旋状流出道嵴. 结论 α-SMA可作为心肌细胞早期分化的标志;流出道嵴内α-SMA阳性细胞可能部分来自神经嵴,部分为正在向间充质细胞分化的内皮细胞.
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上皮细胞转分化的分子机制及意义
在肾脏疾病的进展过程中,转分化机制是重要的致纤维化机制,上皮细胞可能转分化为间充质细胞.本文综述间充质细胞在慢性肾脏疾病中的分子机制、病理意义和治疗干预方面的进展.
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成骨细胞与骨愈合
骨形成是一个生理调节过程,详细了解控制骨形成的分子通路并进行调控,不仅可促进骨折愈合并且可使骨愈合不良达到愈合.成骨细胞是骨形成的主要功能细胞,负责骨基质的合成、分泌和矿化.成骨细胞是特殊的间充质细胞,其基因如核心结合因子(Cbfal)和Osterix(Osx)扮演非常重要的角色.
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间质细胞-上皮细胞转化与人胚胎表皮细胞发生的研究
目的探讨胚胎期表皮细胞形态发生与间质-表皮细胞转化(MET)及其调节因子之间的关系.方法对早期胚胎标本分别采用间质细胞标记物波形蛋白(Vim)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胚胎表皮特异性蛋白细胞角蛋白(CK)8和18、表皮干细胞特异性蛋白CK19和相关调节因素转化生长因子β1(TGFβ1)及其受体(TGFβRⅠ)标记物进行免疫组化、免疫荧光染色和组织形态学观察.结果在人胚胎胎龄(EGA)6～8周期间,外胚层Vim+和α-SMA-细胞向CK8和18+和CK19+表皮干细胞转变,并检测到中等强度(++)TGFβRⅠ信号,但TGFβ1信号十分微弱(±);至EGA 10周以后这些细胞呈现表皮细胞的组织形态学特征.结论 EGA 6～8周是人胚胎表皮细胞经由MET发生的重要时期,TGFβRⅠ信号通路可能参与了MET调节过程,但其配体TGFβ1起源及其作用机制有待进一步研究.
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Hoxc6在胚胎间充质干细胞成骨分化中的作用
目的：研究homeobox c6(Hoxc6)在胚胎间充质干细胞成骨分化中的作用。方法 BMP4诱导小鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2细胞体外成骨分化。逆转录病毒转染C3H10T1/2细胞,构建过表达Hoxc6的稳定转染细胞,进行Hoxc6获得性功能研究。慢病毒转染 C3H10T1/2细胞,构建基因敲除 Hoxc6的稳定转染细胞,进行Hoxc6丧失性功能研究。碱性磷酸酶活性实验检测成骨早期分化指标-碱性磷酸酶活性。实时荧光定量反转录PCR( real time reverse transcription PCR,qRT-PCR)检测成骨分化相关基因-碱性磷酸酶和骨钙素的表达。结果过表达Hoxc6明显增强C3H10T1/2细胞的碱性磷酸酶活性,在mRNA水平促进碱性磷酸酶和骨钙素的基因表达。基因敲除Hoxc6明显抑制C3H10T1/2细胞的碱性磷酸酶活性,明显抑制碱性磷酸酶和骨钙素的基因表达。结论 Hoxc6具有促进胚胎间充质干细胞体外成骨分化的功能。
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Dlx2在胚胎间充质细胞成骨分化中的作用
目的 研究Distal-less homeobox 2(Dlx2)在胚胎间充质细胞成骨分化中的作用.方法 Bmp4诱导小鼠胚胎间充质细胞系C3H10T1/2细胞体外成骨分化.逆转录病毒转染构建过表达及基因敲除的Dlx2细胞稳定转染细胞,进行Dlx2获得性及丧失性功能研究.碱性磷酸酶活性实验检测成骨早期分化指标-碱性磷酸酶活性,实时荧光定量反转录PCR(real time reverse transcription PCR,qRT-PCR)检测成骨分化相关基因-Sp7转录因子、碱性磷酸酶和骨钙素的表达.结果 结果显示过表达Dlx2明显增强胚胎间充质细胞C3H10T1/2的碱性磷酸酶活性.qRT-PCR结果显示过表达Dlx2明显促进Sp7转录因子、碱性磷酸酶和骨钙素的表达.基因敲除Dlx2明显抑制C3H10T1/2细胞的碱性磷酸酶活性,qRT-PCR结果显示基因敲除Dlx2明显抑制Sp7转录因子、碱性磷酸酶和骨钙素的表达.结论 Dlx2具有促进胚胎间充质细胞体外成骨分化的功能.
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颅面部生长发育与错(牙合)畸形的矫正时机(一)
一、颅面骨骼的生长发育在细胞水平,生长有三种方式:一是肥大,即细胞体积的增大;二是增生,细胞数量的增加;三是细胞分泌外基质使得体积增加.软组织的生长是肥大与增生的组合,又称之为间质生长,意味着生长在组织的任何部位都可以发生.而骨组织是已经钙化的硬组织,生长只能发生在骨组织的表面.覆盖在骨表面的软组织骨膜中的间充质细胞可以分化为成骨细胞,成骨细胞分泌细胞外基质并矿化,形成新骨,直接沉积于现存骨的表面.这一过程又称之为膜内成骨.
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转化生长因子-β1通过产生活性氧诱导骨髓间充质干细胞分化为肌成纤维细胞
目的：研究转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）诱导骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells ，BMSCs）向肌成纤维细胞分化的机制。方法：采用全骨髓贴壁培养法体外培养小鼠原代BMSCs ，将对数生长期的P3～P5代BMSCs作为实验细胞，使用不同浓度的TGF-β1诱导BMSCs向肌成纤维细胞分化，并在此基础上观察加入自由基清除剂 N-乙酰-半胱氨酸（ N-acetylcysteine ，NAC）对其分化的影响。采用实时荧光定量PCR及Western blot技术检测BMSCs分化指标α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型胶原[col-lagenα1（Ⅰ），Col α1（Ⅰ）]和Ⅲ型胶原[collagen α1（Ⅲ）， Col α1（Ⅲ）]的表达情况。使用2’，7’-dichlorohydrofluorescein diacetate（DCFH-DA）预孵育BMSCs 15 min，然后加入TGF-β1处理不同时间，检测TGF-β1刺激下BMSCs中活性氧（ reactive oxygen species ，ROS）的产生，并使用高内涵方法对BMSCs中产生的ROS进行统计分析。结果：TGF-β1可以剂量依赖地诱导BMSCs向肌成纤维细胞分化，上调α-SMA、Col α1（Ⅰ）和Col α1（Ⅲ）的表达。 TGF-β1诱导BMSCs分化的作用可以被NAC阻断。 TGF-β1在BMSCs中能够引起ROS的产生，且该过程迅速而短暂，当TGF-β1作用30 min时，其在BMSCs中诱发的ROS达到峰值。结论：TGF-β1通过产生ROS介导BMSCs向肌成纤维细胞分化。
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人羊膜上皮细胞与羊膜间充质细胞干细胞特性的对比研究
目的：体外分离培养人羊膜上皮细胞（haecs）和羊膜间充质细胞（haMscs）对比两种细胞的生物学特性。方法取足月产胎儿胎盘上羊膜，无菌条件下用两步分离法分别提取haecs和haMscs细胞，传代培养。取P3代细胞采用免疫细胞化学、免疫荧光染色、流式细胞术及诱导分化对比两种细胞的生物学特性。结果两种细胞均为贴壁细胞，能在体外稳定传代培养，都能表达干细胞标记物，流式细胞仪检测cdl66、cd29、cd73表达率≥90％，不表达cd34，弱表达Hla-aBc，向成骨细胞、成脂肪细胞分化，具有多能分化的潜能。haecs较haMscs具有更强的贴壁力，早期生长增殖快，P4代后增殖速度减慢，衰退快，多能传到P6代。羊膜间充质细胞可稳定长期传代，对培养基要求不高，多可传至P25代。结论1、haecs具有较强的上皮细胞特性，与haMscs一样保留有干细胞特性，易于获取，早期增殖速度快，增殖周期短，贴壁性强，可缩短临床试验周期。2、与haecs相比，haMscs对培养基的要求不高，且能稳定传代，P15代时仍能保持良好的细胞形态，获取的细胞量大，且具有多能分化的潜能，两者都可以作为干细胞治疗的种子新来源，两者相较haMscs似乎更具有优势。
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间充质干细胞分化机制研究新进展
间充质干细胞是一种非造血干细胞,但拥有向间充质和非间充质组织细胞分化的能力,而且这些细胞通过多种途径,如分泌细胞因子、向其他细胞系分化及细胞与细胞的接触机制等改变临床疾病的病理过程,目前间充质干细胞作为细胞工程种子细胞被越来越多的体内外实验证实其临床使用价值,并进一步推广应用于临床治疗各种免疫系统疾病和其他退行性疾病.因此,对于其本身细胞向各种成熟细胞分化的内在机制的充分了解是非常重要的,借此希望通过对目前的间充质细胞在体内外和临床试验的诱导分化方向的实验做一概述,可以为间充质细胞作为治疗方式提供临床支持依据.
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第一鳃弓外胚间充质细胞定向脂肪细胞的分化
背景:第一鳃弓作为过渡结构,在牙颌面的发育形成过程中,发挥着重要作用.目的:观察第一鳃弓外胚间充质细胞自我更新能力,以及体外诱导分化成为脂肪细胞的可能性.方法:分离培养E9.5 Balb/c胎鼠第一鳃弓外胚间充质细胞,以端粒酶原位杂交和BrdU渗入实验检测外胚间充质细胞的增殖能力.相差显微镜下观察细胞形态变化和生长规律,免疫细胞化学染色鉴定细胞表面标志,cDNA探针原位杂交、免疫荧光化学染色观察细胞增殖能力,油红O染色、RT-PCR产物凝胶电泳观察细胞成脂诱导结果.结果与结论:端粒酶原位杂交和BrdU摄取实验阳性,诱导后细胞表现出典型的脂肪细胞形态,大部分细胞油红O染色阳性,RT-PCR结果显示诱导后细胞表达了脂蛋白脂酶.提示第一鳃弓外胚间充质细胞具有较高的自我更新能力,并可定向诱导分化成为脂肪细胞.
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不同来源间充质干细胞生物学特征的比较
目的:比较脐静脉、成人骨髓及胎儿骨髓3种不同来源的间充质干细胞体外生长特性及分化潜能.方法:①实验于2004-01/2006-06在苏州大学附属第二医院中心实验室完成.孕39～40周健康产妇正常分娩2 h的脐带以及3～4月龄流产胎儿均由苏州大学附属第二医院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意.正常成人骨髓由苏州大学附属第二医院血液科研究生捐献.本实验经医学伦理委员会批准.②脐带用含青、链霉素的磷酸盐缓冲液冲净静脉腔内残血,夹闭两端,经37 ℃预热的1.5 g/L胶原酶消化,重悬于DMEM-LG(含体积分数为0.1的新生牛血清、20 mmol/L HEPES、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1 mmol/L 丙酮酸钠),以108 L-1密度接种于25 cm2培养瓶常规培养,48 h后弃上清,以后每两三天半量换液,3周后用5 g/L胰酶消化传代.③抽取正常成人骨髓5～10 mL,ficoll分离单个核细胞,收取白雾层及以上部分细胞,采用上述培养基按相同条件进行培养,约14～18 d胰酶消化传代.④取流产胎儿,无菌条件下分离股骨,冲洗干净后采用两种方法分离间充质干细胞:直接将胎骨剪成约1 mm3大小的碎片,磷酸盐缓冲液洗涤后加入少量上述培养基,置10 cm培养皿培养;剪去股骨两端后,用上述培养基冲出骨髓腔内细胞,直接培养.⑤观察连续传代对3种不同来源间充质干细胞增殖的影响;免疫荧光及免疫组化分析所得细胞的表型;观察3种不同来源间充质干细胞在诱导培养条件下向成骨及成脂细胞分化的潜能.结果:①不同来源间充质干细胞的体外增殖特性:脐带、成人及胎儿骨髓内均存在间充质干细胞,且细胞形态相似.成人骨髓间充质干细胞的体外增殖能力较差,传至10～12代基本失去增殖能力.脐静脉间充质干细胞的增殖能力强于成人骨髓间充质干细胞,可体外连续传代15～18次.而胎儿来源的间充质干细胞增殖能力及体外传代更新能力均明显强于其他两种间充质干细胞,传至20代时基本保持原有的特性.②不同来源间充质干细胞免疫表型:3种间充质干细胞均高表达CD29、CD44、CD54及HLA-ABC分子,成人骨髓源间充质干细胞还表达中等量的CD106及少量HLA-DR.3种间充质干细胞均不表达造血细胞标志CD34和CD45,其中脐静脉来源的间充质干细胞αSMA呈阳性,vWF呈阴性.③不同来源间充质干细胞的分化潜能:在成脂或成骨条件培养基中,3种间充质干细胞均可向脂肪及成骨细胞分化,油红O及von Kossa染色呈阳性.结论:①脐带、成人及胎儿骨髓内均存在数量不等的间充质干细胞,其形态、生长特性及表面标志具有相似性.②脐静脉源间充质干细胞的增殖能力优于骨髓间充质干细胞,尽管略弱于胎源性间充质干细胞,但其来源广泛、分离方便、间充质干细胞得率高,且没有伦理限制,是一种较好的间充质干细胞来源.
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小鼠腭裂相关基因的克隆及基因表达的意义
目的:筛选并克隆正常组小鼠腭突与腭裂组小鼠腭突组织中差异表达的基因,探讨它们在腭裂发生过程中表达的意义.方法:建立 C57BL/6N小鼠腭裂模型,分别提取胚胎 12 d的正常组及维甲酸处理组小鼠腭突组织中的 mRNA,利用 PCR的改良消减杂交技术,筛选并克隆小鼠腭突正常发育时期与腭裂形成过程中差异表达的基因及测序. 结果:共获得差异表达的基因 40个, 2个为新基因.结论:克隆的新基因及 fau基因可能对腭突间充质细胞的生长、分化具有重要的调控作用.
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大鼠胚胎后肾间充质细胞体外标记的方法
背景:干细胞移植为慢性肾脏病的治疗提供了新的视角,特异性标记干细胞并体内示踪是这一领域研究的基础,目前尚无一种公认的适用于所有细胞的标记方法.目的:观察DAPI及绿色荧光蛋白标记细胞在阿霉素肾病大鼠体内的定位及分化,探讨便捷的大鼠胚胎后肾间充质细胞的体外标记方法.设计、时间及地点:分组对比观察,于2007-04/12在中南大学湘雅二医院完成.材料:清洁级雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只,体质量180～220 g,用于制备阿霉素肾病大鼠模型.方法:分别将DAPI、DAPI体外标记后肾间充质细胞、绿色荧光蛋白体外标记后肾间充质细胞,通过尾静脉注入阿霉素肾病大鼠体内:于细胞移植后1,3,5周行肾组织冰冻切片,观察DAPI及绿色荧光蛋白荧光分布,并ABC免疫酶染色法检测肾组织中绿色荧光蛋白表达.主要观察指标:比较DAPI及绿色荧光蛋白两种不同方法标记后肾间充质细胞在阿霉素慢性肾病大鼠肾内的定植情况,以及绿色荧光蛋白标记细胞不同时间点移植在肾内的定植改变.结果:①DAPI标记细胞及单纯DAPI尾静脉注射后1周,均可在肾小管上皮细胞中观察到DAPI阳性细胞,至移植后5周仍可观察到,但随时间延长荧光有减弱趋势.②绿色荧光蛋白标记细胞移植后1周,可在肾小管上皮细胞中观察到绿色荧光蛋白阳性细胞,至移植后5周仍可观察到,荧光无明显减弱.③ABC免疫酶染色法检测,显示绿色荧光蛋白阳性细胞主要表达于近端肾小管中,肾小球系膜区亦可观察到少表达:绿色荧光蛋白阳性产物主要表达于胞浆.绿色荧光蛋白表达半定量评分显示,标记细胞的早期应用阳性率大于晚期应用者,且随观察时间延长,阳性率有升高趋势.结论;后肾间充质细胞的脂质体感染法绿色荧光蛋白标记是一便捷,有效的体外标记、示踪方法,适于移植细胞的短期内示踪、观察.
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异体骨异位诱导预制骨皮瓣过程中的病理变化
背景：用自体骨皮瓣移植是目前修复复合组织缺损的好方法，但其修复能力有限、创伤大、造成新的组织缺损和一定功能障碍。异体骨具有骨诱导能力，可能用来预制骨皮瓣。目的：观察异体骨异位埋植诱导预制骨皮瓣过程中异体骨的病理变化。方法：实验动物为广西巴马微型猪，将深低温冷冻异体骨埋植于旋髂浅动脉供养的皮瓣组织内，植入后在体观察局部反应情况，于植入后4，8，12，16周随机取出异体骨，行大体观察及病理切片镜下观察。结果与结论：所有异体骨植入处无明显炎症反应。病理检查可见异体骨在皮瓣组织内埋植后4周异体骨表层出现血管化，未见明显类骨母细胞；植入后8周出现异体骨不同程度的血管化、骨吸收和分布不均的类骨母细胞和类破骨细胞，有新骨形成；植入后12周新骨形成进一步增加，但骨吸收亦加重，植入骨形态改变；植入后16周异体骨碎裂吸收，新骨形成无明显增加。结果提示异体骨异位埋植预制骨皮瓣过程中，异体骨随时间不断发生病理变化，需适时移植。
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源于人躯干皮肤真皮的成纤维样细胞的间充质干细胞分化潜能
目的：研究从人皮肤真皮组织中分离培养的成纤维样细胞向中胚层细胞分化的潜能，初步探讨其替代自体骨髓间充质干细胞（BMSCs）用于组织损伤和缺损修复的可行性。方法：将一定大小的成人腹部全层皮肤组织分别用分散酶和Ⅰ型胶原酶消化，分离获得真皮来源总细胞。单层培养扩增的细胞在含有一定浓度 N2、B27、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养液中进行悬浮培养，并收集培养液中悬浮存在的球状细胞聚集体（SDDSs），用含胎牛血清的培养液进一步单层扩增细胞。以免疫细胞荧光法分析细胞和鉴定细胞的分化特性。结果：真皮中分离的一些单个细胞在无血清培养液中分裂增殖形成SDDSs；在含血清的单层培养条件下，从 SDDSs 分离培养的细胞增殖活跃，细胞表达间充质干细胞标志物CD90、CD105和波形蛋白；分别向骨细胞、软骨细胞以及脂肪细胞诱导分化后，呈现类似于 BMSCs分化特点，分化的细胞呈茜素红、番红 O和油红 O特殊染色阳性反应，但真皮细胞分化形成的软骨细胞番红 O染色弱于骨髓干细胞来源的软骨细胞。结论：结合无血清培养和有血清培养法，可从人真皮组织中分离培养具有向软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞分化潜能的细胞，此细胞将有望替代BMSCs用于临床组织损伤修复的再生治疗。
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caveolin-1 mRNA在小鼠牙发育过程中的表达
目的:检测caveolin-1基因mRNA在小鼠牙发育不同时期间充质细胞中的表达,初步探讨caveolin-1在小鼠牙胚发育过程中的作用.方法:以E9.5第一鳃弓间充质细胞及E16.5下颌第一磨牙牙胚细胞作为研究发育机制的模型,应用RT-PCR技术检测caveolin-1 mRNA的表达.结果:caveolin-1 mRNA在两种细胞中均有表达,其在牙胚细胞中的表达水平高于第一鳃弓间充质细胞.结论:caveolin-1可能在牙发育过程中发挥作用.
关键词： Caveolin-1 间充质细胞 发育 -
不同部位喉黏膜间充质细胞的分离培养
目的:探讨不同部位喉黏膜间充质细胞的分离、培养方法,为喉部组织工程提供更多的可供选择的种子细胞.方法:收集临 床上喉部手术病人切下的不同部位的喉黏膜.主要是会厌的背侧黏膜和声带的黏膜,各3例.共计6例.对会厌背侧的黏膜采用消化培养的方法,对声带部位的黏膜采用组织块培养法.后通过免疫荧光染色对两种方法所获得的细胞进行鉴定,确定其来源于喉黏膜的间充质.结果:通过两种方法均可以成功获得相应部位的细胞,免疫荧光染色vimentin均呈阳性表达且CK 均呈阴性 表达,证明了获得的细胞确实是来源于间充质.结论:本实验成功的培养出了喉部不同部位的间充质细胞,为喉部的组织工程提供了更多的可供选择的种子细胞.
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大鼠E12.5胰腺间质细胞原代培养及鉴定
目的:体外分离培养大鼠胚胎胰腺间质细胞(pancreas mesenchymal cells).方法:以孕12.5天(E12.5)的大鼠胚胎为组织来源,通过显微分离得到E12.5的胚胎胰腺,在鼠尾胶原包覆的六孔板内进行组织块培养,观察培养过程中胰芽的形态变化,间质细胞的长出,并用细胞免疫荧光的方法对间质细胞进行了鉴定.结果:显微分离得到了胚胎胰腺,为间质细胞群包绕着上皮细胞团的结构,培养第二天即发现间质细胞的长出,培养第四天时得到间质细胞群,免疫荧光鉴定为vimentin 阳性的间质细胞.结论:本方法通过大鼠E12.5胚胎胰腺显微分离.体外培养出原代胚胎胰腺间质细胞,为进一步研究大鼠胰腺间质细胞的功能提供实验平台.
