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淫羊藿素通过Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成软骨分化
该文研究GDF-5联合淫羊藿素(ICT)诱导BMSCs成软骨分化,并探讨Wnt信号通路在其中的作用.采用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,取P3代细胞分成6组:BMSCs组,ICT组,GDF-5组,GDF-5 +ICT组,GDF-5+ ICT+ SB216763组,GDF-5+ ICT+XAV-939组,连续诱导培养14 d.倒置相差显微镜观察细胞形态学改变;Alcian Blue染色检测蛋白聚糖变化;RT-PCR检测aggTecan,Col2,Sox9,Dvll,Gsk3β,β-catemn mRNA表达水平;Western blot检测Ⅱ型胶原蛋白和β-catenin蛋白表达水平.结果提示,与BMSCs组相比,GDF-5组,GDF-5 +ICT组,GDF-5+ ICT+ SB216763组蛋白聚糖Alcian blue染色均明显较深;成软骨分化标记基因aggrccan,Col2,Sox9 mRNA表达水平及Ⅱ型胶原蛋白表达水平,Wnt信号通路相关基因β-cateninmRNA及蛋白表达均逐渐增加,Gsk3βmRNA表达量逐渐减少.相反,相对于GDF-5+ ICT组,添加XAV-939组则表现为成软骨分化及Wnt信号通路相关基因Dvl1,β-catenin表达下调,Gsk3βmRNA表达增加,Ⅱ型胶原蛋白及β-catenin蛋白表达水平均下降,上述差异均有统计学意义.GDF-5联合淫羊藿素能够诱导大鼠BMSCs成软骨分化,其中ICT起促进作用.ICT可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进大鼠BMSCs体外成软骨分化.
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生长分化因子5调控细胞分化机制研究新进展
生长分化因子5(GDF-5)属于转化生长因子β超家族,成熟的GDF-5含120个氨基酸残基,通过Smads介导和非Smads介导两种方式诱导目的 基因,调控机体的骨骼、软骨等组织的生长发育和修复.近年来,又有研究发现GDF-5能够作用于脂肪来源的间充质干细胞,使其分化成骨、软骨、肌腱.此外,GDF-5在神经系统保护、心脏组织修复等方面的应用前景也越来越受到重视.
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GDF5基因真核表达载体的构建及其在恒河猴骨髓间充质干细胞中的表达
目的 克隆人软骨组织生长分化因子5(GDF5)基因及构建GDF5基因真核表达载体,观察其在恒河猴骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达情况.方法 采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从人胎儿软骨组织克隆hGDF5基因全长cDNA,插入pEGFP-C2载体,构建重组真核表达质粒pEGFP-C2-GDF5.重组质粒脂质体介导法转染MSCs细胞,荧光显微镜观察报告基因的表达,RT-PCR法检测目的基因表达.结果 成功克隆人软骨组织GDF5基因和构建GDF5真核表达质粒pEGFP-C2-GDF5,克隆在载体上的基因长度为1 505 bp,包含全部eDNA编码序列1505 bp,测序显示与Genbank上的序列一致.重组质粒转染恒河猴MSCs细胞得到表达,绿色荧光蛋白在转染24 h后开始表达,72 h达高峰,然后表达逐渐减弱.转染后72 h可检测到GDF5 mRNA表达.结论 人GDF5基因在恒河猴MSCs细胞的成功表达为应用恒河猴模型开展基于细胞的基因疗法修复骨和软骨损伤研究奠定了必要基础.
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生长分化因子5诱导脂肪干细胞向成软骨细胞方向分化的实验研究
目的 通过质粒转染探讨生长分化因子5(GDF-5)诱导大鼠脂肪干细胞向成软骨细胞方向分化的影响.方法选取雄性SD大鼠采用酶消化-密度梯度离心法提取脂肪干细胞行体外培养,并通过流式细胞术鉴定脂肪干细胞.体外培养的脂肪干细胞分3组,即转染组、空质粒组和对照组.转染组采用LipofectamineTM2000进行脂质体pcDNA3.1(+)/GDF-5重组质粒瞬间转染;空质粒组采用空质粒pcDNA3.1(+);对照组只加入等量脂质体.转染后观察各组细胞形态.同时,通过免疫组织化学、免疫荧光检测培养2周后Ⅱ型胶原表达水平,通过甲苯胺蓝染色检测2周后蛋白聚糖表达水平.结果转染2周后,空质粒组、对照组细胞形态未见明显变化,转染组长梭形的细胞明显向成软骨的多角形方向变化.Ⅱ型胶原经免疫组织化学染色,转染组可见棕黄色染色,空质粒组、对照组无明显染色;免疫荧光结果显示,转染组细胞呈亮绿色,空质粒组、对照组均未见明显染性着色.蛋白聚糖经甲苯胺蓝染色后转染组细胞呈蓝染,空质粒组、对照组均未见明显染性着色.结论pcDNA3.1(+)/GDF-5转染脂肪干细胞能显著增加Ⅱ型胶原、蛋白聚糖的表达,促进脂肪干细胞向成软骨细胞方向分化.
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野生型和突变型GDF5蛋白表达及亚细胞定位的研究
目的 研究人生长分化因子5基因(GDF5)c.1118T＞G(p.L373R)突变对GDF5蛋白在HEK-293细胞系表达及其亚细胞定位的影响.方法 构建pDsRed1-N1-GDF5-WT和pDsRed1-N1-GDF5-L373R载体,分别转染HEK-293细胞,细胞培养72h后通过荧光显微镜观察比较野生型和突变型GDF5蛋白荧光分布情况.结果 GDF5蛋白在HEK-293细胞中成功表达,在荧光显微镜下观察到转染野生型和突变型GDF5的细胞胞浆均匀发出红色荧光,而空载体组的红色荧光则弥散于全细胞,荧光强度均匀一致.结论 野生型和突变型GDF5蛋白均定位于HEK-293细胞质.
关键词： 生长分化因子5 基因突变 蛋白表达 HEK-293细胞系 -
人重组pcDNA6.2/生长分化因子5质粒的构建及鉴定
背景:生长分化因子5是一种刺激肌腱、韧带塑型,增强愈合反应有效的生长因子,在活性组织工程肌腱构建中有重要作用.目的:构建人重组pcDNA6.2/生长分化因子5质粒,为转染基质干细胞向肌腱诱导分化实验奠定基础.设计、时间及地点:细胞基因工程体外实验,于2007-08/12在哈尔滨医科大学遗传学教研室和分子生物学教研室完成.材料:根据Genbank(NM000557)中人生长分化因子5的序列化学合成一对引物,从人胎儿软骨组织提取总RNA.方法:通过反转录-聚合酶链反应得到人生长分化因子5完整成熟肽基因.将所得基因片段插入克隆载体pcDNA6.2并转化入JM109菌株,提取重组质粒,PCR鉴定、酶切鉴定并测序.主要观察指标:反转录-聚合酶链反应检测结果,PCR及SalⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定结果,重组质粒测序与Genbank中序列比较结果.结果:电泳显示,反转录-聚合酶链反应产物为一长约380 bp的带,阳性克隆质粒经PCR电泳及双酶切均出现约380 bp的片段.测序表明与Genbank中的序列完全相符.结论:成功构建出人重组pcDNA6.2/生长分化因子5质粒,为组织工程化肌腱过程中种子细胞的制备提供转染质粒.
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生长分化因子5诱导大鼠软骨前体细胞向成软骨方向分化
背景:生长分化因子5和软骨前体细胞都在肢体纵向发育中发挥重要作用.目前尚无生长分化因子5对软骨前体细胞影响的文献报道.目的:实验创新性构思重组生长分化因子5干预软骨前体细胞,希望得到生长分化因子5诱导软骨前体细胞向软骨细胞分化的证据.设计、时间及地点:细胞形态学体外实验,于2007-11/2008-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院矫形外科研究室完成.材料:纯系清洁级新生24 h内的SD大鼠12只,用于制备软骨前体细胞.生长分化因子5为PeproTech公司产品.方法:免疫磁珠分离纯化软骨前体细胞.取第3代细胞,分别用含0,10,50和100 μg/L的完全软骨形成培养基干预,诱导14 d.对照组采用低糖DMEM培养基.主要观察指标:光镜观察细胞形态和生长增殖,四甲基偶氮唑盐检测细胞增殖活性,阿利新蓝染色蛋白聚糖,应用免疫组织化学和反转录-聚合酶链反应检测Ⅱ型胶原的表达.结果:分离纯化的软骨前体细胞贴壁牢固,生长旺盛,折光度好,光镜下呈多角形或梭形. 软骨前体细胞的增殖在48 h内呈剂量依赖性增高,100 μg/L生长分化因子5组细胞的增殖率显著高于其他组(P<0.05).诱导14 d后阿利新蓝染色阳性,细胞外基质中有明显的蛋白聚糖形成.在生长分化因子5干预软骨前体细胞第7天,Ⅱ型胶原mRNA和Ⅱ型胶原蛋白出现表达,并且14 d持续表达.结论:生长分化因子5能够促进软骨前体细胞的增殖分化.
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生长分化因子5诱导脂肪干细胞向软骨细胞的转化
背景：研究表明，生长分化因子5通过不同的调控机制在软骨发育中起到非常重要的作用。
目的：观察生长分化因子5对脂肪干细胞分化的调控作用。
方法：取第4代日本大耳白兔脂肪干细胞，分别以含0(空白对照组)，10，50，100，150，200μg/L生长分化因子5的培养液培养，观察细胞形态变化，筛选出佳生长分化因子5质量浓度。取佳质量浓度生长分化因子5诱导培养1，2，3周的细胞爬片，分别进行免疫组织化学、甲苯胺蓝及免疫荧光染色。
结果与结论：①佳质量浓度：当生长分化因子5质量浓度为10，50μg/L时，细胞形态变化不明显；在200μg/L时，细胞呈现凋亡表现；在100，150μg/L质量浓度下，可见少量细胞由梭形变得不规则，部分细胞在7-10 d变成圆形或椭圆形，其中以100μg/L 生长分化因子5诱导效果好；②免疫组织化学染色：100μg/L生长分化因子5诱导后，转染细胞的Ⅱ型胶原化学染色显示细胞核蓝染，呈强阳性；③甲苯胺蓝染色：100μg/L生长分化因子5诱导后，转染细胞的细胞甲苯胺蓝染色阳性，胞浆异染；④免疫荧光染色：100μg/L生长分化因子5诱导组的蛋白聚糖绿色荧光表达逐渐增强，以诱导3周为强烈；⑤结果表明：长分化因子5可促进脂肪干细胞向软骨细胞转化。 -
生长分化因子5诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架成软骨细胞的分化
背景:前期实验中发现生长分化因子 5 可以诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化,但在复合Ⅰ型胶原支架的体外培养条件下其向软骨细胞分化的能力尚未见研究报道.目的:探讨生长分化因子5诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架向软骨细胞分化的能力.方法:从兔脂肪组织中分离培养脂肪干细胞,使用倒置相差显微镜观察细胞形态,使用免疫荧光对其表型进行鉴定.在复合Ⅰ型胶原支架条件下,加入外源性生长分化因子 5 对脂肪干细胞向软骨细胞进行诱导,在诱导14 d时,采用苏木精-伊红染色和扫描电镜对诱导的细胞进行形态学观察.在诱导7,14和21 d时,采用反转录PCR方法检测诱导的细胞的Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达情况.结果与结论:原代脂肪干细胞贴壁生长,呈梭形、多角形分布,细胞表面抗原CD44、CD49d 阳性,CD106阴性.生长分化因子 5 诱导的脂肪干细胞与Ⅰ型胶原支架黏附良好,增殖能力旺盛,细胞表面存在着大量的细胞外基质分泌,Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达水平明显增加.说明生长分化因子5能够成功诱导复合Ⅰ型胶原支架的脂肪干细胞成软骨细胞分化.
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生长分化因子5真核表达质粒转染小鼠骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化
背景:生长分化因子5是软骨与骨组织形成、发育的重要调解因子,在诱导软骨形成,促进骨、软骨、肌健韧带损伤修复方面发挥重要作用.目的:小鼠骨髓基质干细胞体外转染真核表达质粒pcDNA 3.1(+),生长分化因子5,检测与软骨形成分化相关的细胞外基质及蛋白多糖的表达.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/12在武汉协和医院中心实验室完成.材料:雄性昆明种小鼠20只,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供.生长分化因子5真核表达质粒pCDNA 3.1(+)/生长分化因子5为自备.方法:全骨髓贴壁法体外分离培养小鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞接种到6孔板,在细胞生长到90%融合时开始转染.设立3组:转染组采用Lipofectamine<'TM>2000进行脂质体介导pcDNA3.1(+)/生长分化因子5重组质粒瞬时转染;空质粒组转染窄质粒pcDNA 3.1(+);空白对照组只加入等量脂质体,其余步骤相同.主要观察指标:转染后72 h通过RT-PCR及免疫细胞化学检测生长分化因子5基因与蛋白的表达鉴定转染是否成功,同法检测软骨基质Ⅱ型胶原的表达,转染后14 d阿尔辛蓝染色检测蛋白聚糖的表达.结果:转染组有一大小为219 bp的特异性扩增条带,骨髓基质干细胞胞浆内呈棕色阳性染色;而空质粒组、空白对照组均未发生生长分化因子5基因转录,无特异性扩增条带,且细胞胞浆未见明显染色.转染组町检测到Ⅱ型胶原基因的表达,基因大小225 bp,Ⅱ型胶原细胞胞浆中可见棕黄色染色;空质粒组、空白对照组均未检测到Ⅱ型胶原基因的表达,SP染色均无明显染色.阿尔辛蓝染色后转染组细胞呈蓝染,空质粒组、空白对照组均未见明显异染性着色.结论:pcDNA3.1(+)/生长分化因子5转染骨髓基质干细胞能显著增加Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达,促进骨髓基质干细胞向软骨细胞方向分化.
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生长分化因子5对血管内皮细胞增殖和运动的影响
目的:探讨生长分化因子5 (GDF5)对心肌梗死后血管修复的作用,阐明其修复的机制.方法:体外培养血管内皮细胞,分别以不同浓度(10、50及100μg·L-1)的GDF5作用于细胞,同时设正常对照组,CCK8法和立体培养法检测血管内皮细胞的增殖抑制率和细胞迁移.结果:CCK8实验法,GDF5对血管内皮细胞的增殖有抑制作用,随着GDF5剂量的增加,抑制率也相应地增加达2倍以上,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).立体培养法检测,GDF5对血管内皮细胞的运动有明显促进作用,随着GDF5剂量的增加,细胞运动明显增快,不同浓度GDF5组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:GDF5对血管内皮细胞增殖起到抑制作用,对血管内皮细胞的迁移起到促进作用.
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稳定过表达生长分化因子5基因大鼠脂肪干细胞系的建立
目的:探讨慢病毒介导的稳定过表达生长分化因子5(GDF-5)基因大鼠脂肪干细胞(ASCs)的构建条件和方法.方法:取大鼠腹股沟脂肪垫组织,采用Ⅰ型胶原酶消化贴壁法分离培养大鼠ASCs.倒置相差显微镜观察细胞形态,CCK-8法测定细胞生长曲线,流式细胞仪鉴定细胞表型.制备带GDF-5/GFP融合基因的慢病毒载体系统,探索不同感染复数(MOI=1、5、10、20、40、60、80、100)的转染效率,选择佳MOI,采用流式细胞仪检测转染效率.对转染细胞行流式细胞筛选,测定筛选后转染细胞的阳性率.筛选出的细胞行细胞爬片,DAPI染色,形态学上进一步验证细胞阳性率;并采用CCK-8法检测转染后细胞活力.结果:成功培养大鼠ASCs,流式细胞免疫表型鉴定:间充质干细胞表面抗原(CD90、CD29、CD44、CD105)表达阳性,造血细胞表面抗原(CD45、CD34)和骨髓干细胞表面抗原(CD106)表达阴性.成功构建GDF-5过表达慢病毒载体系统,慢病毒转染大鼠ASCs佳MOI为40,转染率为65%.采用GFP荧光流式细胞筛选技术筛选后阳性率可提高至96%.CCK-8法显示,转染后细胞活力、生长曲线与未转染细胞无明显差异.结论:胶原酶消化法可成功培养大鼠ASCs,流式细胞筛选技术可显著提高转染细胞阳性率,且对细胞系活力无显著影响,转染细胞传代5代仍可稳定过表达.
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GDF5基因rs224331多态性与汉族青少年体格发育指标关联分析
目的 探讨中国汉族青少年GDF5基因rs224331位点多态性与身高、体重和BMI的相关性.方法 采集江苏省某技校1 790名17~22岁青少年的身高、体重指标并计算BMI.采用Taqman探针real-time PCR方法 检测GDF5基因rs224331位点的单核苷酸多态性,并分析该基因位点与男女生身高、体重和BMI的相关性.结果 97.9%(1 754/1 790名)基因分型成功,男生859名,女生895名.rs224331位点频率高的基因型为AA(51.7%),其次为AC(39.6%),CC少(8.7%).rs224331的基因型分布与男生、女生的身高无显著关联(P分别为0.728和0.723);rs224331不同基因型间的男生体重和BMI差异均有统计学意义(P均<0.01),男生AC基因型体重和BMI均显著高于AA基因型(P=0.002),女生中未发现类似的相关性(P分别为0.713和0.921).结论 GDF5基因rs224331位点多态性在本研究的汉族人群中与身高无明显关联,提示该多态性位点可能存在种族特异性.rs224331位点多态性与男生体重和BMI存在相关性.
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脂肪间充质干细胞中Noggin下调能够促进GDF5的表达
目的:通过抑制细胞中Noggin的表达,观察其对大鼠脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)中生长分化因子5(growth differentiation factor 5,GDF-5)表达量的影响,探究两者之间的关系.方法:构建GDF5慢病毒过表达载体(Lv-GDF5)及Noggin干扰载体(Lv-Noggin shRNA),根据目的基因的不同,将实验分成4组,分别使用重组慢病毒转染大鼠ADSCs:A组为Lv-EGFP转染ADSCs(空载体病毒转染组);B组为Lv-Noggin shRNA转染ADSCs;C组为Lv-GDF5转染ADSCs;D组为Lv-GDF5+Lv-Noggin shRNA共转染ADSCs.通过实时定量PCR技术和Western blot技术检测转染后14 d GDF5和Noggin的表达量,进行对比分析.并检测软骨基质二型胶原(collagenⅡ,Col-Ⅱ)mRNA的表达,进行组间比较.结果:实时定量PCR结果显示:转染后14d,A、B、C、D组GDF5 mRNA表达量呈递增趋势,两两之间比较,除B组与C组之间差异无统计学意义外,其余各组间差异均有统计学意义(P＜0.05);各组间Noggin mRNA表达量比较,A组＞C组＞B组＞D组,两两比较,除A组与C组间差异无统计学意义外,其余各组间差异均有统计学意义(P＜ 0.05);Col-ⅡmRNA表达量呈递增趋势,两两比较,差异均有统计学意义(P＜ 0.05).Western blot结果显示:转染后14d,A、B、C、D组GDF5蛋白表达量呈递增趋势,两两比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);各组间Noggin蛋白表达量比较,A组＞C组＞B组＞D组,两两比较,A组与C组、C组与B组间差异无统计学意义,其余组间差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:抑制大鼠ADSCs Noggin的表达,GDF5表达量相应增加,两者呈负相关关系.
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GDF5单核苷酸多态性与退变性腰椎间盘疾病的相关性
目的 探讨生长分化因子5(GDF5)基因rs143383单核苷酸多态性(SNP)与退变性腰椎间盘疾病(LDD)的相关性.方法 从272例LDD患者、311例对照人群外周血白细胞中提取基因组DNA,并采用Taqman探针法行SNP分析.结果 在显性模型(TT vs.TC/CC)(P=0.041,OR=1.42,95％ CI=1.01-1.98)、隐性模型(TT/TC vs.CC) (P=0.031,OR=0.43,95％ CI=0.19-0.94)以及女性患者(P=0.023,OR=1.83,95％ CI=1.20-2.79)中,SNP位点rs143383与IDD均呈显著相关性(P=0.012,OR=1.43,95％ CI=1.08-1.88).结论 GDF5对LDD的发生发展起着重要的作用.
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生长分化因子5在椎间盘退行性变疾病中的研究进展
长年劳损、慢性疾病或脊柱外伤等造成的椎间盘退行性变疾病(intervertebral disc degeneration disease,IDD)为临床的常见病和多发病,是引起下腰痛的主要病因.传统的治疗方法包括非手术保守治疗和手术治疗,虽然在一定程度上可缓解临床症状,但不能解决根本问题,还会引起相应的并发症.椎间盘细胞自我修复能力也极为有限,许多促进其再生和修复的方法不太令人满意.近年来研究发现,生长分化因子5(growth and differentiation factor -5,GDF5)除了参与调节骨骼系统正常发生和发育,修复受损的骨、软骨、关节、肌腱、韧带、神经、血管、牙组织以外,还能有效修复退变的椎间盘.因其能促进椎间盘细胞蛋白多糖及Ⅱ胶原mRNA的表达,增加细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成,在延缓甚至逆转IDD领域巳被大量研究.本文综述了近年来GDF5及其在IDD中的研究进展.
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生长分化因子5促进软骨细胞肥大成熟的实验研究
[目的]探讨生长分化因子5(GDF-5)在诱导成人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成软骨分化的同时,促进其肥大成熟的作用.[方法]体外分离培养hBMSCs,取第四代细胞实验.将细胞消化、悬浮,以5×106/ml的细胞密度进行高密度培养,分别用含0.500ng/ml GDF-5的软骨诱导液(CM)诱导培养3、4周.免疫组化、甲苯胺蓝染色检测Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和蛋白多糖的表达情况.荧光实时定量RT-PCR检测两组微团Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和蛋白多糖mRNA的表达情况.[结果]实验组微团中的细胞体积较对照组稍大,细胞密度稍低.甲苯胺蓝和免疫组化染色结果显示各组微团均有Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和蛋白多糖的表达和分泌,且4周实验组的表达为强烈.荧光实时定量RT-PCR检测示,干预后3周实验组Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因表达量明显高于3周对照组(P＜0.05),但Ⅹ型胶原基因表达与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)；干预后4周实验组Ⅹ型胶原基因表达高于其余各组(P＜0.05),Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因表达明显高于两对照组(P＜0.05),但与3周实验组相比较,差异无统计学意义(P＞0.05).[结论]GDF-5在诱导细胞成软骨分化的同时,还可促进其成熟肥大.
关键词： 成人骨髓间充质干细胞 生长分化因子5 软骨分化 成熟肥大 -
不同细胞接种密度体外构建“自组装”工程化软骨的实验研究
[目的]探究以人骨髓间充质干细胞(humanbonemarrowmesenchymalstemcells,hMSCs)为种子细胞体外构建“自组装”工程化软骨对应的合理细胞接种密度.[方法]体外分离与培养hMSCs.用含100ng/ml生长分化因子5(growthdifferentiationfactor5,GDF-5)的软骨诱导液(chondrogenicmedium,CM)定向诱导培养第3代hMSCs,诱导3周后重悬细胞,分别以A组2.5×106/ml,B组5×106/ml,C组1x107/ml,D组2×107/ml四种细胞密度接种于2％琼脂糖包被的24孔板,每组设5个复孔.自组装培养3周后,对标本进行大体观察、组织学及免疫组化检测并进行生化分析,比较不同组标本的软骨生物学特性的差异.[结果]“自组装”培养3周后,各组都形成了软骨样组织团块,团块直径与湿重随细胞接种密度而增加.Bem评分结果显示C、D两组明显高于A、B两组(P＜0.05),且C组与D组间差异无统计学意义,Ⅱ型胶原免疫组化染色检测到C组与D组细胞外基质内有较强的阳性信号弥漫分布,蛋白多糖(GAG)含量C、D两组亦明显高于A、B两组(P＜0.05),且C组与D组间差异无统计学意义.[结论]在一定细胞接种密度范围内,“自组装”工程化软骨的生物学特性呈密度依赖性增加.以1×107/ml接种时,可以获得具有良好生物学特性的“自组装”工程化软骨.
关键词： 成人骨髓间充质干细胞 生长分化因子5 "自组装"培养 软骨分化 -
生长分化因子5诱导人骨髓间充质干细胞微团成软骨分化的研究
[目的]探讨应用生长分化因子5(growth differentiation factor5,GDF-5)诱导人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSCs)微团成软骨分化的可行性及效果.[方法]体外分离培养hMSCs,取第3代细胞实验.将hMSCs分别用无血清H-DMEM和含10、20、50、100ng/ml GDF-5的软骨诱导液(chondrogenic medium,CM)诱导,显微镜下观察细胞形态变化,MTT法检测各组细胞的增殖情况.诱导2周后重悬细胞,以5×106/ml的细胞密度离心构建微团,继续诱导2周.RT-PCR检测两组细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达.免疫组化、甲苯胺蓝染色检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达.[结果]hMSCs呈梭形、漩涡状生长.100ng/ml GDF-5诱导的hMSCs呈圆形或多角形.五组微团分别由无血清H-DMEM、含10,20,50,100ng/ml GDF-5的软骨诱导液诱导2周后,除H-DMEM组无Ⅱ型胶原mRNA、Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖的表达外,其他各组Ⅱ型胶原mRNA、Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖的表达呈浓度依赖性增加,各组差异均有统计学意义(P＜0.05).[结论]经一定浓度GDF-5诱导的hM-SCs微团,Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达呈浓度依赖性增加,具有软骨的部分生物学功能.
关键词： 成人骨髓间充质干细胞 生长分化因子5 微团培养 软骨分化 -
GDF5基因启动子表达载体的构建
目的 构建含人生长分化因子5(GDF5)基因启动子表达载体pGI3-GDF5,为研究GDF5在骨骼、肌肉发育的作用机制提供实验基础.方法 扩增人GDF5基因启动子序列,克隆至pG13-Basic表达载体并转化人大肠杆菌DH106,双酶切鉴定并测序.结果 PCR扩增后的产物在约854bp处出现明显的特异性条带,酶切鉴定结果与理论预测值一致,测序未出现碱基突变.结论 成功构建了含GDF5基因启动子的表达载体.
关键词： 生长分化因子5 pGL3-Basic载体 质粒
