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蛋白酶体抑制剂对白血病细胞系细胞周期的影响
近年来的研究显示蛋白酶体抑制剂可诱导多种人肿瘤细胞系的凋亡,机制之一是其对细胞周期的影响.本实验就蛋白酶体抑制剂Z-LLL-CHO对白血病细胞系M-07e、TF-1、HL-60细胞周期的影响进行了初步研究.应用MTT法显示Z-LLL-CHO对三株白血病细胞系呈不同程度的细胞杀伤效应.流式细胞仪检测显示应用2.5μmol/L Z-LLL-CHO 8h后可使G2/M期细胞比例增加,此种效应在S+G2/M期比例高的HL-60中为显著.对凋亡峰的考察发现,Z-LLL-CHO作用后可使细胞凋亡峰的比例增加,但与其对细胞周期的影响程度无明显相关性.上述结果提示蛋白酶体抑制剂作用后可使白血病细胞系G2/M期细胞比例增加,细胞对其诱导凋亡的敏感性与细胞周期受影响的程度无明显相关性,提示其他的相关机制参与了蛋白酶体抑制剂诱导白血病细胞凋亡的调控.
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分泌IL-21的白血病细胞系的建立及其抑瘤作用
目的 建立及鉴定稳定表达白介素21的4种白血病细胞系,并初步分析其刺激活化的淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤功能.方法 构建携带白介素21和红色荧光蛋白基因的质粒,包装慢病毒,感染4种白血病细胞系,连续传代后,通过荧光显微镜、流式细胞仪和ELISA法鉴定建立的4种细胞系.以稳定分泌IL-21白血病细胞为抗原刺激外周血单个核细胞增殖,细胞分析计数仪检测增殖倍数,流式细胞仪分析淋巴细胞的表型,细胞计数试剂盒(CCK8)检测增殖后的淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用.结果 建立稳定表达IL-21的4种细胞系:K562-IL-21、THP-1-IL-21 、jurkat E6-1-IL-21和RPMI8226-IL-21.3份人PBMC在4种分泌IL-21的白血病细胞的作用下都有增殖,增殖倍数在1.147±0.057 ～2.725±0.345倍之间.不同数量的IL-21分泌白血病细胞都可激活淋巴细胞增殖,增殖的倍数在1.127 ±0.152～2.213±0.200之间.增殖后CD3+T淋巴细胞和CD56+ NK细胞的比例降低(P＜0.05),CD19+B淋巴细胞比例增加(P＜0.05);由分泌IL-21白血病细胞激活后的淋巴细胞对母系白血病细胞的杀伤作用明显高于对照组.由分泌IL-21白血病细胞激活后的淋巴细胞对母系白血病细胞和其他7种肿瘤细胞均有杀伤作用,杀伤率在(28.68±9.31)％～(78.45±0.61)％之间.结论 4种分泌IL-21的白血病细胞可刺激PBMC增殖并激活其对肿瘤细胞的杀伤作用.
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Livin在白血病耐药细胞系THP-1R的表达
Livin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族新成员,在正常组织极少表达,而在多数恶性肿瘤组织细胞中高表达,与肿瘤抗凋亡和耐药性有关[1].为探讨Livin与白血病细胞耐药的相关性,本实验主要从分子水平研究Livin在人急性白血病细胞系THP-1与耐药细胞系THP-1R中的差异表达情况,为Livin在白血病多药耐药( multi-drug resistance,MDR)方面的意义提供实验依据.1材料与方法1.1材料主要试剂:RPMI 1640培养液(Promega公司);兔抗Livin抗体(博奥森生物技术有限公司);引物(上海生工生物工程公司);RT-PCR试剂盒(MBIFermentas公司);双链siRNA和RNAi-Mate转染试剂(上海吉玛生物技术公司).1.2方法1.2.1细胞培养:THP-1细胞为本室冻存,用含10％小牛血清的RPMI 1640培养液在37℃、5％ CO2条件下培养,2～3d传代1次.采用逐渐增加药物浓度的方法[2]建立THP-1耐Ara-C的耐药系THP-1R,实验前2周撤去药物,以正常的RPM1640培养液培养,然后取对数生长期细胞用于后继实验.1.2.2 siRNA转染:参考文献[1],针对人Livin基因2个异构体的共同部分合成siRNA序列,正义链5’-GACAGUGCC AAGUGCCUGCdTdT-3’,反义链5'-GCAGGCACUUGGCACUG UCdTdT-3’.按照说明书所述比例配制siRNA/RNA-Mate复合物和完全培养基的混合液,用此混合液稀释细胞至所需浓度,再分配到培养板各孔.非转染对照组用生理盐水代替siRNA.同时转染有荧光标记的阴性对照siRNA,在荧光显微镜下观察和判断转染效果.
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β-catenin在白血病细胞系中表达的研究
本研究检测β-catenin在白血病/淋巴瘤细胞系中的表达,探讨其与白血病的关系.采用半定量RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot的方法检测β-catenin在白血病细胞系中的表达.结果表明:白血病细胞系中β-catenin在转录水平上有广泛表达,其中:在U937、KG1a、Jurkat、K562、Namalwa细胞中存在极高表达;在HEL、HUT78、Raji、Daudi、CEM中有中等表达;而在LCL-H、HL-60、NB4、J6-1、Ramos细胞中β-catenin mRNA呈相对较低水平的表达.蛋白表达水平与mRNA表达水平结果一致.所检测的细胞系中,胞核中均可见β-catenin的表达,但程度不一;在U937、K562、KG1a和Jurkat细胞的胞核内可见大量分布.结论:β-catenin作为WNT/β-catenin信号转导途径中重要的"调节子",其在白血病细胞中的过量表达提示WNT/β-catenin信号转导途径可能在白血病细胞中有异常激活.
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Lrp16基因在白血病细胞系及白血病患者骨髓中的表达及其临床意义
本研究分析lrp16基因在白血病细胞系及白血病患者骨髓中的表达,探讨lrp16基因与白血病发生、发展的关系.采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测lrp16基因mRNA在4种白血病细胞系及115例白血病患者骨髓中的表达水平,并结合患者临床特征分析lrp16基因在白血病发生、发展中的作用.4种白血病细胞系包括慢性髓系白血病细胞系K562、急性早幼粒细胞白血病细胞系HL-60、急性淋巴细胞白血病细胞系MOLT4及具有单核细胞特征的白血病细胞系U937.结果表明:lrp16基因在K562、HL-60、MOLT4及U937 4种细胞系中均表达.lrp16基因在急性髓系白血病患者表达阳性率为38%(16/42),其中完全缓解者表达阳性率为13%(4/30),朱缓解者为100%(12/12);在急性淋巴细胞白血病患者表达阳性率为38%(10/26),其中完全缓解者阳性率为16%(3/18),未缓解者为87%(7/8);在慢性髓系白血病患者表达阳性率为36%(9/25),其中完全缓解者阳性率为20%(4/20),未缓解者为100%(5/5);在慢性淋巴细胞白血病患者表达阳性率为31%(7/22),其中完全缓解者阳性率为11%(2/17),未缓解者为100%(5/5).lrp16基因表达在各种白血病亚型之间无差异,但各亚型中完全缓解者与未缓解者之间存在显著差异(p<0.001).结论:lrp16基因是一个白血病癌基因,与白血病的发生、发展密切相关,有可能作为临床白血病治疗疗效的评价指标.
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逆转录病毒介导p16基因转移引起K562白血病细胞系的增殖抑制
为探讨p16基因对白血病细胞增殖的影响,为白血病发生机理的研究和p16的基因治疗提供实验依据,我们构建了p16的逆转录病毒载体pLMSN,新型双嗜性包装细胞PT67和单嗜性包装细胞ψ包装后,体外转导p16基因缺失的K562细胞.用RT-PCR与荧光免疫法检测外源性P16蛋白的表达,流式细胞术测定细胞周期,活细胞计数观察细胞增殖情况,进行软琼脂集落形成实验.结果表明,转导后K562-p16细胞中可检测到P16蛋白的表达,细胞生长曲线显示细胞增殖明显减慢,G0-G1细胞数增多,RB蛋白去磷酸化,细胞在软琼脂中形成集落能力下降.以上结果提示p16编码序列体外可以抑制白血病细胞的增殖,抑制作用是通过Rb抑制途径实现的.逆转录病毒介导的p16基因转移对白血病的基因治疗具有一定意义.
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白血病细胞系来源的树突状细胞诱导及其抗肿瘤免疫功能研究
树突状细胞(DC)在抗肿瘤免疫反应中起关键作用,但大多数白血病病人有DC功能缺陷.在体外扩增DC并增强其抗肿瘤免疫功能及以DC为基础的肿瘤疫苗是对白血病有效的免疫治疗方法.为了探讨由不同的髓性白血病细胞系诱生DC的条件及其抗白血病反应,选用HL60,K562和THP-1细胞与不同的细胞因子组合诱生DC,以光学和电子显微镜术观察形态特征,用流式细胞术和单克隆抗体检测细胞表型,以同种混合淋巴细胞反应观察刺激淋巴细胞增殖,用51Cr释放法检测诱生细胞的细胞毒作用,用ELISA法测定DC培养及DC+血单个核细胞联合培养的血清中IL-12及IFN-γ的量.结果表明,由K562,HL-60和THP-1细胞诱生的DC具有树突状细胞的形态学特征,细胞表达DC的表面分化抗原,其中GM-CsF+IL-4+TNF-γ刺激HL-60-DC和THP-1-DC和GM-CsF+IL-4+IL-12刺激的K562-DC中有抗原表达.3种细胞诱生的DC对混合淋巴细胞反应及CTL反应有强刺激作用.诱生DC的培养上清和DC与血单个核细胞共培养上清中分别测出不同量的IL12和IFN-γ.结论提示,细胞因子能诱导髓性白血病细胞产生DC,不同细胞需要不同的细胞因子和培养条件.这些DC表达抗原呈递细胞的表型具有刺激T淋巴细胞增殖和诱导CTL反应以及分泌IL-12和促进T细胞分泌IFN-γ的作用.
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细胞外调节蛋白激酶与端粒酶对肝癌和白血病细胞系凋亡的调控作用
为了观察化疗药物三尖杉酯碱(HRT)、长春新碱(VCR)和依托泊苷(VP-16)抑制肝癌细胞系SMMC7721和白血病细胞系K562细胞增殖、促进细胞凋亡过程中端粒酶活性及细胞外调节蛋白激醇(ERK)磷酸化蛋白表达水平的变化,应用MTT、流式细胞术、端粒重复序列扩增法(TRAP)、生物发光分析及Western印迹等方法进行了检测和分析.研究结果发现,一定浓度的化疗药物作用24小时后,可以抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡;在同样作用条件下,端粒酶活性和磷酸化ERK1/2的表达也受到一定程度的抑制,其中以HRT的作用明显.结论:HRT,VCR和VP-16可能是通过抑制Ras/Raf/MEK/ERK1/2信号传导通路、降低ERK活性、减少ERK1/2靶基因的转录活化、间接下调端粒酶活性这一共同的作用机制而发挥作用的;细胞凋亡是端粒持续缺失的的结果.
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毒胡萝卜素诱导K562细胞凋亡及其机制的实验研究
本研究旨在探讨毒胡萝卜素对K562细胞的凋亡诱导作用及其可能机制.采用荧光显微镜观察凋亡细胞的形态变化,annexinV-FITC/PI双染法FCM检测凋亡率的变化,Ca2+荧光指示剂Fura-2/AM法荧光分光光度计测定细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的改变,Rh123单染法FCM检测线粒体△ψm的变化,Western blot检测caspase-3,-7,-9,-12、细胞色素C和GRP78蛋白的改变.结果显示:4 μmol/L毒胡萝卜素作用K562细胞48小时后,荧光显微镜观察到细胞呈典型的凋亡形态变化,早期凋亡细胞核染色质呈固缩状、圆珠状或斑块状;晚期凋亡细胞核染色质呈固缩状或斑块状.1、2、4、8 μmog/L毒胡萝卜素作用K562细胞24和48小时后细胞凋亡率分别为7.51%、11.65%、23.22%、30.56%和12.85%、20.27%、31.51%、44.16%,在一定范围内呈剂量和时间依赖性,与对照组比较,均有统计学意义(P＜0.05).毒胡萝卜素诱导K562细胞[Ca2+]i升高以及线粒体△ψm下降,并均呈一定的浓度依赖性,与对照组比较,均有统计学意义(P＜0.05).Westem b1ot检测显示,毒胡萝卜素诱导K562细胞caspase-3,-7,-9,-12剪切活化、细胞色素C释放、GRP78表达上调.结论:毒胡萝卜素可诱导K562细胞发生内质网应激反应性凋亡,内质网是细胞内诱导凋亡的一个重要新场所;caspase-3,-7,-9,-12剪切和活化、线粒体△ψm破坏和细胞色素C释放是毒胡萝卜素诱导K562细胞凋亡的重要机制之一,线粒体参与内质网应激反应性凋亡途径并发挥重要作用.
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多克隆细胞系的研究价值——J6-1人白血病细胞系30年研究评述
J6-1细胞系是我国建立的第一株人白血病细胞系,是EBV和HHV-6双重感染的多克隆细胞系.J6-1细胞系建系30年来,从J6-1细胞克隆了许多细胞因子、受体及其他基因,提供了许多有关白血病细胞性质和功能的信息,从而衍生出多项研究课题,而所有这些显示出多克隆细胞系特有的研究价值.本文就30年来J6-1人白血病细胞系的研究作一评述,包括J6-1细胞系的异质性和多克隆性,J6-1细胞群体的生存机制和J6-1细胞系的异常细胞间通讯及其意义,以及J6-1细胞系的启示.
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蛋白酶体抑制剂可增加足叶乙甙对白血病细胞系M-07e和TF-1的凋亡诱导效应
近年来的研究显示泛素-蛋白酶体通路在细胞凋亡调控中发挥了重要的作用.本实验就蛋白酶体抑制剂Z-LLL-CHO与经典的凋亡诱导剂足叶乙甙(VP16)对白血病细胞系M-07e及TF-1的联合效应进行了初步研究.应用MTT法及台盼蓝拒染法显示Z-LLL-CHO及VP16联合作用于M-07e及TF-1细胞,可增强两种药物单独的细胞杀伤效应.流式细胞术检测提示单独应用Z-LLL-CHO及VP16均可使S+G2/M期细胞比例增加,两者联合应用导致细胞凋亡峰比例的显著增高.通过对M-07e细胞裂解物做免疫印迹检测,发现在Z-LLL-CHO及VP16单独作用中均导致Bcl-2蛋白被酶解为22 kD的片段,而联合作用时Bcl-2的酶解现象具有叠加效应.结论: Z-LLL-CHO与VP16联合作用较单独作用有更强的细胞杀伤及诱导细胞凋亡活性,细胞周期S+G2/M期比例的增加及Bcl-2酶解片段的增加是导致蛋白酶体抑制剂Z-LLL-CHO及VP16对白血病细胞系联合效应的可能机制.
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明胶酶A、B在脐血CD34+细胞及部分白血病细胞系中的表达
目的研究骨髓及脐血CD34+细胞及白血病细胞系的明胶酶,即基质金属蛋白酶-9(MMP-9,明胶酶B)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2,明胶酶A)的产生, 探讨它们在CD34+细胞迁移、归巢中的意义及在白血病发病中的作用.方法通过Mini MACS磁珠分离技术分离脐血及骨髓的CD34+细胞, 通过酶谱分析法测定脐血、骨髓CD34+细胞及白血病细胞系的无血清条件培养液中明胶酶的表达.结果在脐血CD34+细胞的条件培养液中可测出相对分子质量为92×103的亮带, 骨髓CD34+细胞的条件培养液中未测到亮带.部分白血病细胞系U937、KG-1a、HL-60可产生相对分子质量为92×103和72×103的亮带, J6-1、J6-2细胞系可产生相对分子质量为92×103的亮带,而HEL、Namalva、CEM、K562、LCL-H不产生亮带.结论脐血CD34+细胞可产生MMP-9, 而骨髓CD34+细胞不产生,脐血CD34+细胞具有较强的穿透基底膜的迁移能力并与MMP-9相关.在白血病细胞系中, 部分髓系白血病细胞系产生MMP-9和MMP-2, 而非髓系白血病细胞系不产生.
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白血病细胞系K562侧群细胞的分选及其初步研究
近年来对干细胞和肿瘤研究的深入,已表明干细胞自我更新和肿瘤的生成有惊人的相似之处,而且肿瘤中某些数量极少的细胞具有干细胞特性,提出了肿瘤干细胞学说[2],认为肿瘤干细胞是肿瘤的转移、复发和耐药的根源.
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高压氧联合阿霉素对白血病K562/A02细胞周期及移植瘤生长的影响
高压氧作为辅助治疗手段已广泛应用于临床[1],有关高压氧对白血病细胞多药耐药的影响研究尚少,我们拟通过体外细胞培养及构建裸鼠移植瘤模型实验,探讨0.2 MPa高压氧联合阿霉素(ADM)逆转多药耐药白血病细胞系K562/A02细胞耐药性的效果.
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藤黄菌素对人白血病细胞系HL-60体外增殖的影响
目的:观察藤黄菌素对HL-60细胞体外增殖的抑制作用及其对细胞周期的影响.方法:分别采用台盘蓝拒染法及流式细胞术,在不同条件下测定细胞增殖的抑制率及细胞周期的分布.结果:应用台盘蓝拒染法,藤黄菌素能够显著地抑制HL-60细胞的体外增殖并且呈现时效及量效关系.流式细胞术的结果表明:藤黄菌素作用2 h可使HL-60细胞的细胞周期分别阻滞于G2/M期和G0/G1期.结论:藤黄菌素能够明显抑制HL-60细胞体外增殖.
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抗菌肽hCAP-18/LL-37 5'非翻译区的分析
抗菌肽hCAP-18/LL-37在天然免疫中起重要作用,我们以前的工作发现,hCAP-18/LL-37 mRNA在人白血病细胞系中广泛表达,但仅少数细胞系可检测到hCAP-18/LL-37蛋白表达.表明其表达调控主要在转录后水平[1].
关键词： hCAP-18/LL-37 5'非翻译区 白血病细胞系 -
急性髓系白血病血管内皮生长因子表达与预后的研究
目的:观察人白血病细胞系血管内皮生长因子(VEGF)表达水平,研究急性髓系白血病(AML)患者血清VEGF表达水平与预后的关系.方法:采用酶联免疫吸附法(ELISA)对49例初治、10例复发AML患者血清及人白血病细胞系U937、K562、HL-60、TF-1和NB4培养上清液(48小时)VEGF表达水平进行检测.结果:五种人白血病细胞系培养上清液中均测到VEGF高表达.49例初治、10例复发AML患者的血清VEGF表达水平分别为201.17±110.93pg/ml和232.59±118.62pg/ml,均明显高于正常对照组(125.62±45.43pg/ml;p＜0.05).初治AML患者中VEGF高表达组(＞201.17pg/ml)完全缓解(CR)率为48%,低表达组(＜201.17pg/ml)CR率为77%,两者比较差异显著(p＜0.05).结论:血管内皮生长因子在刺激白血病细胞增殖、迁移中发挥重要作用.AML患者血清VEGF水平与预后具相关性.
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HPLC检测白血病细胞系CYP3A5活性方法的建立与应用
目的建立白血病(AL)细胞系CYP3A5活性检测方法,研究化疗药对其活性的调控.方法HPLC法检测药物干预后AL细胞系CYP3A5活性.结果以1×106细胞、氢化考的松终浓度100 μmol/L、孵育24 h为AL细胞体外培养条件下氢化考的松6β-羟化活性检测的孵育条件.K562细胞CYP3A5活性显著高于HL 60、NB4和Jurkat细胞.柔红霉素作用24 h后K562细胞CYP3A5活性增高,48 h后活性显著增高;而NB4与Jurkat细胞在其作用后活性无改变.地塞米松作用24 h后Jurkat细胞CYP3A5活性显著增高,48 h后活性又显著增高.全反式维甲酸作用24 h后NB4细胞CYP3A5活性显著增高,72 h后活性又显著增高.结论HPLC检测AL细胞体外培养条件下氢化考的松6β-羟化活性方法的建立可用于研究AL细胞CYP3A5活性.柔红霉素、地塞米松、全反式维甲酸的应用可诱导某些AL细胞株CYP3A5活性.
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柔红霉素、地塞米松、全反式维甲酸对白血病细胞系CYP3A5基因转录及活性的调控
目的探讨化疗药对白血病细胞系CYP3A5基因转录及活性的调控.方法采用RT-PCR、高压液相色谱法(HPLC)检测药物干预后白血病细胞系CYP3A5基因的转录及活性.结果 K562/A02细胞经柔红霉素作用后CYP3A5转录增强,HL-60/ADR细胞则经诱导后出现CYP3A5转录.Jurkat细胞经地塞米松作用24 h后出现微弱的CYP3A5转录,48 h后转录明显增强.NB4细胞经全反式维甲酸作用24～96 h均诱导出现CYP3A5转录.K562细胞的CYP3A5活性显著高于HL-60、NB4和Jurkat细胞.柔红霉素作用24 h后K562细胞的CYP3A5活性增高,48 h后活性显著增高;而NB4和Jurkat细胞在柔红霉素作用24 h后CYP3A5活性无改变.地塞米松作用Jurkat细胞、全反式维甲酸作用NB4细胞均能诱导CYP3A5活性显著增高,并呈时间依赖性.结论柔红霉素、地塞米松、全反式维甲酸的应用可诱导某些白血病细胞株CYP3A5基因的转录及活性.
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人髓性白血病细胞VEGF及其受体的检测
目的建立人髓性白血病细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体KDR和Flt-1在基因转录和蛋白质水平上的检测方法,为临床判断白血病患者的预后提供技术支持.方法用RT-PCR测定K562和HL-60 2种白血病细胞VEGF及其受体mRNA表达,免疫组织化学染色法检测VEGF及其受体蛋白表达;ELISA法检测细胞上清液中VEGF的分泌水平.结果2种髓系白血病细胞均检测到VEGF的基因转录和蛋白表达.HL-60细胞同时表达Flt-1和KDR 2种受体,而K562细胞仅有受体Flt-1的表达,未见受体KDR的mRNA和蛋白表达.细胞培养上清液中检出VEGF的高分泌.结论VEGF及其受体在髓性白血病细胞表达增高,但不同细胞系VEGF受体表达有差异.VEGF及其受体在白血病的发生、发展中可能起重要作用.
