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IL-2基因转染逆转绒癌耐药细胞系多药耐药性
用 RT-PCR的方法克隆人的I L- 2基因,将IL-2基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,通过阳离子脂质体将IL-2基因转染用足叶乙甙(VP-16)诱导建立的绒癌耐药细胞系JEG-3/VP16,用G418筛选含IL-2 DNA 片段的单个细胞克隆,检测转染前后细胞对5-氟尿嘧啶(5-Fu),氨甲蝶呤( MTX), VP -16, 更生霉素(KSM),紫杉醇( TAXOL)耐药指数的变化,用RT-PCR的方法测定转染前后细胞IL-2和多种耐药基因包括肺耐药蛋白(LRP), 多药耐药相关蛋白(MRP),谷胱甘肽转移酶(GST-π),二氢叶酸还原酶(DHFR)和多药耐药基因(MDR-1)的mRNA表达情况. 结果表明转染IL-2的细胞中用RT-PCR的方法检测到IL-2 mRNA表达,转染IL-2基因的细胞耐药指数降低,MDR-1 mRNA表达转阴,而其它耐药基因的表达无明显改变.
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Livin在白血病耐药细胞系THP-1R的表达
Livin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族新成员,在正常组织极少表达,而在多数恶性肿瘤组织细胞中高表达,与肿瘤抗凋亡和耐药性有关[1].为探讨Livin与白血病细胞耐药的相关性,本实验主要从分子水平研究Livin在人急性白血病细胞系THP-1与耐药细胞系THP-1R中的差异表达情况,为Livin在白血病多药耐药( multi-drug resistance,MDR)方面的意义提供实验依据.1材料与方法1.1材料主要试剂:RPMI 1640培养液(Promega公司);兔抗Livin抗体(博奥森生物技术有限公司);引物(上海生工生物工程公司);RT-PCR试剂盒(MBIFermentas公司);双链siRNA和RNAi-Mate转染试剂(上海吉玛生物技术公司).1.2方法1.2.1细胞培养:THP-1细胞为本室冻存,用含10％小牛血清的RPMI 1640培养液在37℃、5％ CO2条件下培养,2～3d传代1次.采用逐渐增加药物浓度的方法[2]建立THP-1耐Ara-C的耐药系THP-1R,实验前2周撤去药物,以正常的RPM1640培养液培养,然后取对数生长期细胞用于后继实验.1.2.2 siRNA转染:参考文献[1],针对人Livin基因2个异构体的共同部分合成siRNA序列,正义链5’-GACAGUGCC AAGUGCCUGCdTdT-3’,反义链5'-GCAGGCACUUGGCACUG UCdTdT-3’.按照说明书所述比例配制siRNA/RNA-Mate复合物和完全培养基的混合液,用此混合液稀释细胞至所需浓度,再分配到培养板各孔.非转染对照组用生理盐水代替siRNA.同时转染有荧光标记的阴性对照siRNA,在荧光显微镜下观察和判断转染效果.
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人食管癌顺铂耐药细胞系Ec9706/cDDP的建立及其生物学特征
目的:建立人食管癌顺铂耐药细胞系Ec9706/cDDP,探讨其生物学特征.方法:采用顺铂(cDDP)中等浓度、间歇作用方法历时9 mo建立耐药细胞系Ec9706/cDDP,采用MTT法测定其对cDDP的耐药指数,观察冻存、撤药对耐药性的影响,比较耐药与亲本细胞生长曲线、群体倍增时间及贴壁率的不同,流式细胞仪测细胞周期,软琼脂实验测细胞的恶性增殖能力,罗丹明实验测其对药物的摄入、排出能力.结果:人食管癌顺铂耐药细胞系Ec9706/cDDP的耐药指数为15.7,冻存对耐药性影响不大,撤药培养可使耐药性降低,耐药细胞群体倍增时间延长(29.79±0.48 h vs 25.79±0.45 h,P＜0.05),生长缓慢,G0/G1、S期细胞比例增加(63.18%±5.21% vs 52.81%±4.36%,P＜0.05;36.49%±3.93% vs 26.70%±2.62%,P＜0.05),G2期细胞减少(0.33%±0.02% vs 20.49%±3.71%,P＜0.05),克隆形成率明显高于亲本细胞(69% vs 24%,P＜0.05),对罗丹明的摄入减少,排出增多.结论:成功建立了人食管癌顺铂耐药细胞系Ec9706/cDDP,且耐药性较稳定.
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人骨肉瘤耐药细胞系MG-63/PTX的建立及多药耐药机制研究
目的 建立人骨肉瘤细胞多药耐药亚系,探讨骨肉瘤细胞多药耐药的发生机制.方法 采用紫杉醇大剂量间断冲击培养法,诱导建立紫杉醇耐药骨肉瘤细胞系(MG-63/PTX),并运用MTT法检测6种药物敏感性变化及细胞生长规律变化,流式细胞仪分析亲本细胞系和耐药细胞系的细胞膜表面P-gp蛋白表达率、罗丹明123排出情况,RT-PCR检测细胞内耐药基因的变化,免疫细胞化学法检测细胞内P-gp蛋白的表达,Westernblotting法检测细胞内P-gp蛋白的表达.结果 历时12个月建成人骨肉瘤耐药细胞系MG-63/PTX,能在含PTX1μg/mL的培养基中稳定生长并传代,其对PTX的耐药指数为69.8,并与卡铂、顺铂、表柔比星、甲氨蝶呤、阿霉素等多种化疗药物存在不同程度的交叉耐药性;罗丹明123排出实验显示MG-63/PTX内罗丹明含量明显低于亲本细胞;RT-PCR结果显示在MG-63/PTX细胞系中存在MDR1、MRP1、LRP、ABCG2基因的表达,而在MG-63细胞系中无MDR1基因的表达.免疫细胞化学、流式细胞仪及Western blotting实验均显示在MG-63/PTX中存在P-gp的表达.结论 MDR1/ P-gp在多药耐药的特性上起着至关重要的作用,而且骨肉瘤多药耐药细胞亚系为进一步研究骨肉瘤耐药特征及逆转方法打下基础.
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膀胱癌组织中谷胱甘肽转移酶π的表达及意义
膀胱癌术后40%～70%复发或再发,即使膀胱内灌注化疗药物,也有相当比例术后复发或再发[1].多药耐药(multidrug resistance,MDR)是指抗某种细胞毒物的耐药细胞系对许多结构上无关的和作用机制不同的其他抗癌药物产生交叉抗药性,被认为是多种肿瘤化疗失败的主要原因.
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HL-60及COC1细胞亲代及耐药细胞系中细胞外调节蛋白激酶与端粒酶活性变化
我们研究了急性早幼粒细胞白血病细胞系HL-60及其耐药细胞系HL-60/E6、卵巢癌细胞系COC1及其耐药细胞COC1/DDP中细胞外调节蛋白激酶(ERK)及端粒酶活性的改变,以了解ERK信号传导途径和端粒酶在白血病和卵巢癌耐药形成中的意义.
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卵巢癌顺铂耐药细胞系的建立及耐药机制的研究
顺铂(cisplatin,DDP)是一种有效的抗肿瘤药物,耐药的产生极大地影响卵巢癌患者对化疗的敏感程度,限制了其临床疗效[1].本研究采用中等浓度、间歇作用[2]的方法,于1998年12月到1999年5月建立了人卵巢癌细胞株SKOV3对顺铂耐药细胞系SKOV3/DDP,对耐药指数、细胞周期分布、细胞内谷胱甘肽(GSH)含量、拓扑异构酶Ⅱ(TOPⅡ)含量及活性进行检测,从细胞水平、分子生物学水平对其基本特征及耐药机制进行研究.
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人胃腺癌长春新碱耐药细胞系耐药机制的研究
化疗是胃癌主要疗法之一,尤其对已处于转移和播散期的胃癌患者,有效化疗是延长生存期必不可少的方法.然而肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性常会造成化疗失败,耐药原因又相当复杂.我们采用免疫细胞化学和RT-PCR法,从蛋白、分子水平对MKN28/VCR、MKN45/VCR进行耐药相关因素分析,阐明它们的耐药机制.
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绒癌耐药细胞系的建立及获得性耐药机制的研究
目的:采用目前治疗绒癌常用的药物诱导建立绒癌的耐药细胞系,比较不同药物引起耐药机制的差异.方法:采用浓度梯度递增法和间歇诱导法,分别用 5-FU,MTX,VP-16诱导绒癌细胞系JEG-3,建立相应耐药细胞系,采用MTT法测定耐药细胞系对 5-FU、MTX 、KSM 、VP-16和Taxol的耐药指数,用RT-PCR测定亲本细胞及各耐药细胞系耐药相关基因如肺耐药蛋白(LRP)、多药耐药相关蛋白(MRP)、谷胱甘肽转移酶(GST-π)、二氢叶酸还原酶(DHFR)和多药耐药基因(MDR-1)的mRNA表达,比较各种细胞生长曲线,细胞群体倍增时间 .结果:JEG-3细胞系在诱导耐药细胞前即有LRP、MRP、GST-π、DHFR的共表达,诱导耐药后上述各基因的表达无明显变化.诱导耐药前JEG-3细胞无MDR1的表达,用VP-16、5-FU间歇诱导的方法诱导形成的耐药细胞系有MDR-1表达,且耐药指数增加.结论:JEG-3耐药细胞系耐药性的产生与MRP、LRP、GST-π、DHFR表达的关系不密切,而与MDR1的表达有关.
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人食管癌顺铂耐药细胞系的建立及耐药相关基因的筛选
目的:建立人食管癌顺铂耐药细胞系Ec9706/cDDP,并初步探讨其耐药机制.方法:采用顺铂(cDDP)中等浓度、间歇冲击作用方法历时9mon诱导人食管癌细胞系Ec9706,建立相应耐药细胞系,采用MTT法测定耐药细胞系对cD-DP的耐药指数,用RT-PCR半定量方法测定亲本细胞及耐药细胞耐药相关基因如DNA聚合酶(polβ)、多药耐药相关基因(MRP)、谷胱甘肽转移酶(GST)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、拓扑异构酶(TPO)和多药耐药基因(mdr1)等基因的mRNA表达水平.结果:人食管癌顺铂耐药细胞系Ec9706/cDDP的耐药指数为15.7,该细胞系中polβ、DHFR、GST基因mRNA的表达比亲本细胞显著增加,TPO的表达降低,而mdr1、MRP表达的增加无显著统计学意义.结论:成功建立了人食管癌顺铂耐药细胞系Ec9706/cDDP,其耐药性的产生与polβ、GST、DHFR、TPO等基因的异常表达有关,而与mdr1、MRP表达的关系不密切.
关键词： 食管癌 耐药细胞系 耐药相关基因 DNA聚合酶beta -
B超引导下建立裸鼠原位肝细胞癌多药耐药模型
为更好地反映活体肿瘤的情况,我们利用已建立的耐药细胞系在B超引导下建立一种原位肝癌耐药动物模型,为进一步研究多药耐药(MDR)的逆转提供良好的动物平台.
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细胞素及合用异博定对人乳腺癌细胞多药耐药性逆转作用的研究
我们利用人乳腺癌耐药细胞系以流式细胞术及噻唑蓝(MTT)法检测肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-2、α-干扰素(α-IFN)单用及与异博定合用对细胞耐药性的调节作用,结果报道如下.
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ATP结合盒转运体基因在鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中的表达
目的 分析ATP结合盒转运体基因在鼻咽癌细胞对紫杉醇产生耐药过程中的作用.方法 采用大剂量紫杉醇冲击和逐渐增加剂量相结合的方法建立鼻咽癌紫杉醇耐药细胞系CNE-1/Taxol,运用包含49个ATP结合盒转运体家族成员的Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0芯片分析鼻咽癌紫杉醇耐药细胞系CNE-1/Taxol及其亲本细胞系CNE-1 之间的基因表达差异.结果 发现了ABCA7、 ABCB10、ABCC1、 ABCC4、ABCC5、 ABCC6、ABCD4和ABCG2八个在耐药细胞中表达上调2倍以上的ATP结合盒转运体基因,这些基因在CNE-1/Taxol的表达随半数抑制剂量的紫杉醇处理后均表现不同程度的下降.结论 ATP结合盒转运体家族成员的上述8个基因可能与鼻咽癌细胞的紫杉醇耐药产生有关.
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沉默SIRT2基因抑制AML耐药HL60 A细胞株的增殖
目的：探讨靶向干扰SIRT2基因表达对急性粒细胞白血病（ AML）多药耐药细胞株HL60A细胞增殖的影响。方法：针对SIRT2基因构建shRNA真核表达载体，制备慢病毒并感染HL60A细胞。沉默SIRT2基因之后，改良MTT法检测对HL60A细胞活力的影响；甲基纤维素集落形成实验观察对HL60A细胞集落形成能力的影响；采用流式细胞术检测分析对HL60A细胞的细胞周期的影响。结果：干扰组SIRT2基因的表达量被有效抑制；干扰SIRT2基因表达量后，HL60A细胞的细胞活力明显下降，集落形成数量减少及集落的形状减小，细胞被明显阻滞于G1／S期。结论：shRNA靶向干扰SIRT2基因的表达可有效抑制急性粒细胞白血病耐药细胞系HL60A细胞的增殖。
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紫杉醇诱导的卵巢癌耐药基因表达谱与信号通路分析
目的:探讨卵巢癌细胞对紫杉醇的耐药分子机制.方法:取对数生长期细胞按Trizol一步法抽提细胞总RNA,应用人类全基因组基因芯片检测卵巢癌耐药细胞株SKOV3/TS与敏感细胞株SKOV3细胞基因表达谱的变化,GO TermMapper软件鉴定差异基因功能,进一步利用IPA软件分析基因通路网络,筛查获得性紫杉醇卵巢癌耐药的相关基因.结果:紫杉醇诱导的卵巢癌耐药差异表达基因分别与细胞生长增殖,细胞合成和装配,细胞死亡,细胞周期调控和细胞信号传导相关.涉及DNA修复功能,DNA复制和细胞周期阻滞的基因主要是过度表达,而在代谢相关基因(特别是脂质代谢),信号传导,免疫和炎症反应,运输,转录调控和蛋白质的合成则是抑制表达.网络分析结果表明微管蛋白网络和以BAX为节点的细胞凋亡信号转导通路被促进.结论:紫杉醇耐药主要是与细胞合成与装备(包括许多微管蛋白基因诱导相关的基因和通路),脂质代谢、细胞粘附和细胞凋亡相关.BAX蛋白从微管蛋白释放被抑制可能是诱导卵巢癌细胞耐药的重要原因.
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MGr1-Ag维持耐药表型与蛋白激酶C有关
［韩英，时永全，郑永悦，聂永战，张宏博，张淼莉，潘伯荣，樊代明. 世界华人消华杂志，2001;9(5):517-521］ 目的探讨MGr1-Ag维持耐药表型与蛋白激酶C的关系. 方法用免疫细胞化学方法检查MGr1-Ag在胃癌SGC7901细胞系及耐药亚系的表达；ELISA及点印迹方法检测胃癌SGC7901细胞系及其耐药亚系细胞培养上清中MGr1-Ag的表达；免疫荧光双标记及共聚焦显微镜技术观察MGr1-Ag与PKCα的相关表达；竞争蛋白结合法检测单克隆抗体MGr1-1对PKC活性的影响. 结果 MGr1-Ag在胃癌SGC7901细胞系及耐药亚系均有表达，以耐药细胞表达明显增多；ELISA及点印迹实验证实在表达MGr1-Ag的细胞培养上清中均可检测到MGr1-Ag；耐药细胞PKCα与MGr1-Ag的相关表达较药敏细胞明显增强；单克隆抗体MGr1-1与耐药细胞共同孵育后，耐药细胞PKC的活性减低，以细胞质的PKC降低较明显. 结论 MGr1-Ag可能是一种分泌蛋白，MGr1-Ag维持SGC7901/VCR耐药细胞系的耐药表型可受PKC信号转导通路的调节.(何扬举
