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Livin在白血病耐药细胞系THP-1R的表达
Livin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族新成员,在正常组织极少表达,而在多数恶性肿瘤组织细胞中高表达,与肿瘤抗凋亡和耐药性有关[1].为探讨Livin与白血病细胞耐药的相关性,本实验主要从分子水平研究Livin在人急性白血病细胞系THP-1与耐药细胞系THP-1R中的差异表达情况,为Livin在白血病多药耐药( multi-drug resistance,MDR)方面的意义提供实验依据.1材料与方法1.1材料主要试剂:RPMI 1640培养液(Promega公司);兔抗Livin抗体(博奥森生物技术有限公司);引物(上海生工生物工程公司);RT-PCR试剂盒(MBIFermentas公司);双链siRNA和RNAi-Mate转染试剂(上海吉玛生物技术公司).1.2方法1.2.1细胞培养:THP-1细胞为本室冻存,用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液在37℃、5% CO2条件下培养,2~3d传代1次.采用逐渐增加药物浓度的方法[2]建立THP-1耐Ara-C的耐药系THP-1R,实验前2周撤去药物,以正常的RPM1640培养液培养,然后取对数生长期细胞用于后继实验.1.2.2 siRNA转染:参考文献[1],针对人Livin基因2个异构体的共同部分合成siRNA序列,正义链5’-GACAGUGCC AAGUGCCUGCdTdT-3’,反义链5'-GCAGGCACUUGGCACUG UCdTdT-3’.按照说明书所述比例配制siRNA/RNA-Mate复合物和完全培养基的混合液,用此混合液稀释细胞至所需浓度,再分配到培养板各孔.非转染对照组用生理盐水代替siRNA.同时转染有荧光标记的阴性对照siRNA,在荧光显微镜下观察和判断转染效果.
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oxLDL对正常人外周血单个核细胞LOX-1及uPAR表达的影响
目的:探讨不同时间点不同浓度oxLDL对正常人外周血单个核细胞uPAR、LOX-1蛋白的表达情况的影响。
方法:选取正常人外周血经Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC),用含20%自体血清的RPMI1640完全培养基培养。Western Blot方法检测不同浓度oxLDL对正常人单个核巨噬细胞干预24 h,72 h的uPAR、LOX-1的蛋白表达。统计分析:western blot以TotalLab Quant软件进行积分光密度值分析。统计分析,计量资料以Mean±SE表示,组间比较以one-way ANOVA进行分析,两组比较采用t检验,P<0.05则有统计学意义。 -
溶血磷脂酸对培养小鼠大脑皮层神经元的双重作用:抗凋亡和促凋亡
应用DNA电泳分析、HO33342和TUNEL染色法、以及部分地使用透射电镜技术,检测了不同浓度的溶血磷脂酸(1ysophosphatidic acid,LPA)对离体培养的小鼠大脑皮层神经元存活情况的影响.结果显示,低浓度的LPA(0.1~30μmol/L)对去血清培养所致的皮层神经元凋亡有浓度依赖性的保护作用,而较高浓度的LPA(>50 μmol/L)不仅不表现这种保护作用,而且可引致培养在含血清的完全培养基中的皮层神经元出现凋亡.以上结果表明,适当浓度的LPA对凋亡的皮层神经元起着保护因子或抗凋亡因子的作用,而较高浓度的LPA则起着促凋亡因子的作用.
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表没食子儿茶素没食子酸酯对结肠癌HCT-8和HT29细胞株的作用及对Notch1与Notch2的基因表达的影响
表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶多酚中含量高、活性强的单体,具有抗癌作用[1]。本研究旨在观察EGCG对结肠癌细胞HCT-8和HT29细胞增殖的抑制作用及对Notch1与Notch2基因的影响,探讨其抑癌机制。一、材料与方法1.噻唑蓝(MTT)比色法检测EGCG对细胞增殖的抑制作用:将细胞接种于96孔板中,将孔中添加终质量浓度为0 mg/L(对照组),10、20、35 mg/L EGCG(实验组)的完全培养基,孵育24、72 h,加入CCK-8反应液,酶标仪读数后,计算抑制率。
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人大颗粒淋巴细胞抗菌多肽的分离
新近的资料表明T淋巴细胞和NK细胞具有直接抗细菌、真菌和寄生虫作用,其分子基础受到关注.现已报道从猪细胞毒性T细胞和NK细胞发现一链长为78个氨基酸残基的小分子抗菌肽,并对肿瘤细胞亦具细胞毒性.本文报道从人大颗粒淋巴胞浆颗粒中分离抗菌多肽.取健康人外周新鲜血,用淋巴细胞分层液分离单个核细胞,离心洗涤,用RPMI 1640完全培养基(含rIL-21 000 U/mL),于37℃,5% CO2孵箱培养7 d.收集IL-2刺激的淋巴细胞,0.34 mol/L蔗糖匀浆,经差速离心获得胞浆颗粒,用5%乙酸提取酸性可溶物.电泳凝胶/琼脂糖弥散抗菌技术发现三条抗菌蛋白带.经制备性AU-PAGE获得HLP-1、和HLP-2和HLP-3等3个抗菌组分,琼脂糖弥散抗菌试验显示对大肠杆菌、绿脓杆菌和金色葡萄球菌等均具很强抗菌活性.SDS-PAGE分析显示HLP-3已为纯化分子,其分子量约为7 kD;HLP-2包含3个多肽,分子量范围5.6~8.8 kD;HLP-1组分相当复杂,包含6个多肽分子,分子量范围5.5~13.0 kD.
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血清代用品在羊水细胞培养染色体分析中的应用
细胞培养已从完全使用天然培养基,发展到人工培养液添加血清.血清中含有大量促生长物质,是细胞培养的重要成分.但是,血清中也含有一定的细胞毒性物质和抑制物质,对细胞生长有一定负作用,影响细胞功能的表达[1].近年来,人们试图研制一种去除血清中有害物质的完全培养基,以满足临床科研和实验诊断的需要.法国IBF公司研制了一种Ultroser的血清代用品,可部分代替小牛血清,国内有少数实验室使用过[2,3],但因价格昂贵,不易购得而受到限制.我们研制的血清代用品(serum supplement, SS)用于外周血淋巴细胞培养进行染色体分析[4],达到了较好的效果,现用于羊水细胞培养作染色体检查.