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蟑螂变应原Cr-PI包涵体的变复性研究
本研究优化了GST-Cr PI融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达条件和GST-Cr PI包涵体的复性条件;采用Glutathione SepharoseTM 4B亲和层析分离纯化融合蛋白,以Xa酶切去掉其GST标签后,对Cr PI进行了电喷雾电离串联质谱分析(ESI-MS/MS).结果表明,IPTG浓度对该蛋白的诱导效果影响不大,OD600值为0.6时诱导效果佳;复性蛋白浓度和L-精氨酸浓度对稀释复性结果有重要影响.纯化融合蛋白经Xa酶切、分子筛层析去掉GST标签后,重组蛋白的纯度达95%,经质谱进一步鉴定为蟑螂Cr PJ变应原.
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包涵体变复性技术研究进展
现代生物技术的迅猛发展使大规模表达异源重组蛋白成为现实,这极大地促进了蛋白类产品的开发,尤其是重组蛋白药物的研发.目前非糖基化的重组蛋白表达多采用大肠杆菌的原核表达系统,该系统的突出特点是表达产物多以包涵体形式存在.与蛋白可溶性表达相比,包涵体具有产量高、蛋白稳定、容易纯化等优点,对毒性蛋白制备尤其适宜.因此,采用包涵体形式已成为规模制备重组蛋白产品的主要途径之一.
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人血管内皮抑制素vasostatin120-180在大肠杆菌中的表达纯化及初步的抗血管生成活性研究
目的:在大肠杆菌中克隆和表达人源血管内皮抑制素vasostatin120-180(VAS)基因,并进行分离纯化及抑制新生血管生成活性鉴定.方法:根据大肠杆菌偏爱密码子,应用化学合成和分子克隆方法得到人源血管内皮抑制素120-180片段(即VAS)的编码基因.通过PCR和限制性内切酶消解,将VAS编码基因克隆入大肠杆菌表达载体pET28a中,并在BL21(DE3)菌株中经IPTG诱导、表达带有His融合标签的His-VAS重组蛋白.VAS蛋白的表达水平大约占细菌总蛋白的45%,大多数目的蛋白以包涵体形式存在,经过体外包涵体变性、复性及纯化,采用SDS-PAGE分析鉴定,用鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验进行重组蛋白活性的生物活性鉴定.结果:经DNA序列分析鉴定,重组质粒pET28a-VAS构建成功,IPTG诱导后的融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,Western blotting分析并鉴定了VAS的分子属性.通过鸡胚尿囊膜试验验证,重组VAS蛋白能够很好地抑制微血管生成.结论:获得高效表达的、高纯度的VAS,为VAS进一步的功能分析和抑制血管生成活性研究奠定了基础.
关键词： 偏爱密码子 血管内皮抑制素120-180 包涵体 变复性 鸡胚尿囊膜试验
