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Med19基因在恶性肿瘤中的研究进展
恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病,随着人们生活方式、生活环境的改变,恶性肿瘤的发病率越来越高,死亡率一直居于首位.肿瘤的发生、发展主要与癌基因的突变、扩增、过度表达以及抑癌基因的突变、失活等密切相关.在人体内Med19基因已经定义为肿瘤相关基因,目前已发现Med19与多种恶性肿瘤的增殖、转移及周期调控有关.现就Med19基因在恶性肿瘤中的研究进展作如下综述.
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整合因子复合体研究进展
整合因子复合体（ integrator complex ）是一个新近发现的多功能蛋白质复合物，由至少12个进化上保守的亚基（ integrator complex subunits ， INTS1～INTS12）组成。该复合体能与RNA聚合酶Ⅱ（ RNAPⅡ）大亚基的具有重复氨基酸序列的C端相互作用，进而介导小核RNA（small nuclear RNA， snRNA）U1／U2的3′端加工。整合因子复合体还能通过与RNAPⅡ、延伸负调控因子NELF和转录延伸因子Spt5发生相互作用，调控NELF介导的RNAPⅡ的暂停－释放，进而调控mRNA的合成。近年来，有研究陆续报道整合因子复合体还在DNA损伤应答、核周动力蛋白的募集、细胞核内卡哈尔体（ Cajal body ）的完整性、脂肪细胞的分化成熟、造血、初级纤毛的形成、肿瘤的发生发展和病毒微小RNA（ microRNA，miRNA）形成等方面发挥重要作用。该文综述了整合因子复合体的研究进展。
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前列腺癌相关microRNA的研究进展
microRNA(miRNA)是近年来研究活跃的细胞调控因子.和传统的蛋白因子不同,miRNA是一种19到22个核苷酸之间的非编码RNA,能在转录和翻译水平上调控基因表达.其作用机理为:在细胞核内,miRNA基因经RNA聚合酶Ⅱ转录出具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的原初miRNA(pri-miRNA),pri-miRNA被核酸酶Drosha切断,生成70个核苷酸的具有茎环结构的miRNA前体(pre-miRNA).
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免疫应答中基因表达的转录延伸调控
基因转录是一个有序的多步骤过程,包括转录起始前、转录起始和转录延伸等几个阶段.长期以来,转录起始前及转录起始阶段调控一直被认为是基因转录的关键限速步骤.然而,近年来利用全基因组深度测序等新技术对转录过程的深入研究,发现转录起始后的转录延伸阶段也是许多基因表达调控的关键步骤,并且这种调控机制在从果蝇到哺乳动物的不同物种之间高度保守.本文综述了NELF、DSIF和P-TEFb等主要转录延伸调控因子调控RNA聚合酶Ⅱ转录暂停和高效转录延伸新分子机制,并讨论了转录延伸调控在癌症、炎症以及病毒感染等疾病发生中的作用.
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Med19在肿瘤领域的研究
中介体(Mediator,Med)是RNA聚合酶Ⅱ通用转录装置的重要组成部分,在真核mRNA合成的活化和阻抑中起着关键作用.其早是在研究酵母RNA聚合酶Ⅱ转录功能时发现的[1],并在近年的研究中发现Med复合物的亚基组成及其相关的可能功能活性.
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RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU对PKR磷酸化的调节作用
目的 研究ALU自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子对RNA聚合酶Ⅱ转录的影响,探讨RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU对PKR磷酸化的调节作用.方法 将ALU全基因序列插入pcDNA3.1(-)载体的CMV启动子(一个RNA聚合酶Ⅱ启动子)的下游,构建重组质粒pcDNA3.1-ALU;转染HEK 293细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR筛选稳定表达ALU的细胞;用干扰素处理稳定表达ALU序列的细胞,Western blot法检测PKR的磷酸化水平.结果 ALU全基因序列插入pcDNA3.1载体的CMV启动子直接下游,能够被RNA聚合酶Ⅱ有效转录;在稳定表达ALU的HEK 293细胞中,加干扰素与未加干扰素组PKR的磷酸化水平均明显高于相应的HEK 293细胞对照组.结论 ALU自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子对RNA聚合酶Ⅱ转录无明显影响,但与RNA聚合酶Ⅲ启动下转录的ALU不同,RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU失去了对干扰素的拮抗作用,反而可以通过形成双链RNA的方式激活PKR的活性.
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RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列对HEK293细胞凋亡的影响
目的 探讨RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列对人胚肾293(HEK293)细胞凋亡的影响以及干扰素(IFN)在此机制中的作用.方法 取对数生长期的HEK293细胞,分为6组,ALU-293组(瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-ALU)、peDNA3.1-293组[瞬时转染空质粒peDNA3.1(-),作为阴性对照],Poly Ⅰ:C-293组[瞬时转染dsRNA的多聚肌苷胞苷酸(Poly Ⅰ:C),作为阳性对照]、IFNβ-293组(加入1.65×104U IFNβ,作为阳性对照)、空白对照组(未经处理的HEK293细胞)和HBs-293组(瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-HBs),转染后48 h,采用MTT法检测细胞的增殖活性;Cellular DNA Fragmentation ELISA和DNA Ladder 法检测细胞的凋亡情况;Real-time PCR检测细胞中IFNβ基因mRNA的水平.结果 瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-ALU能够抑制HEK293细胞增殖,并促使其凋亡,且细胞中IFNβ mRNA的水平显著上调.结论 RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列能够通过激活干扰素系统来诱导细胞凋亡.
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毒蕈中毒的机制与治疗进展
毒蕈中毒是威胁人类健康的全球性问题.鹅膏毒肽是引起毒蕈中毒常见的毒素,致死率极高.鹅膏毒肽的中毒机制主要是其对核糖核酸(RNA)聚合酶Ⅱ活性的抑制.毒蕈中毒的治疗包括支持治疗、毒物清除、药物治疗、肝移植等.毒蕈中毒缺乏高效的解毒药物和治疗手段,仍需要更多的研究与探索.
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小鼠生发泡期卵母细胞成熟过程中转录沉默机制的探讨
目的:探讨小鼠生发泡卵母细胞成熟过程中发生大规模转录沉默的机制.方法:选用4～6周龄ICR雌性小鼠,分离生发泡(germinal vesicle,GV)期卵母细胞,运用RNA聚合酶Ⅱ抗体(anti-RNA PolⅡCTD,clone 4H8)及其羧基末端结构域(CTD)基团第2位丝氨酸磷酸化的抗体(anti-RNA PolⅡCTD Ser2-P,clone H5)、组蛋白H3K4/H3K9三甲基化的抗体(antiH3K4me3、anti-H3K9me3)进行免疫荧光染色.观察伴随GV期小鼠卵母细胞染色质构型由非包围核仁(non-surround nucleolus,NSN)型转变为包围核仁(surround nucleolus,SN)型的过程,这两对标记物的表达及分布变化.结果:在NSN型的GV期卵母细胞中,RNA PolⅡCTD Ser2-P于核浆中呈特征性斑块状分布,同时H3K4me3在核浆中也显示强阳性信号；但在SN型卵母细胞中,RNAPolⅡCTD Ser2-P失去特征性分布,转变为核浆中弥漫性分布,H3K4me3的核浆中阳性信号也消失.结论:RNA聚合酶Ⅱ的活性降低及组蛋白修饰状态的改变在小鼠GV期卵母细胞成熟过程的大规模转录沉默中发挥了重要作用.
关键词： 生发泡卵母细胞 转录沉默 RNA聚合酶Ⅱ 组蛋白H3K4/K9三甲基化 -
基于miR30骨架的HPSE-shRNA慢病毒载体的构建及其效应研究
目的:模拟miR30的框架结构设计针对HPSE的shRNA,将其克隆至慢病毒载体的CMV启动子调控的表达框内,实现Ⅱ型启动子对RNAi的有效调控.方法:设计3条基于miR30骨架的HPSE-shRNA,通过PCR获得目的片段,回收后与线性化LV PP-GFP载体连接产生重组慢病毒载体LV PP-GFP /miR-HPSE-shRNA,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV PP-GFP/miR-HPSE-shRNA、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒,感染A375细胞.以实时荧光定量PCR检测HPSE-mRNA的表达情况,以Westen blot检测HPSE蛋白的表达水平.结果:构建出以miR30为骨架的针对HPSE的慢病毒干扰载体,经阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确.实时荧光定量PCR和Westen blot结果表明,LV PP-GFP/miR-HPSE-shRNA重组病毒感染后A375细胞HPSE-mRNA和蛋白的表达明显降低.结论:本研究成功构建了以miR30为骨架的HPSE-shRNA慢病毒载体,实现了Ⅱ型启动子对RNAi的有效调控,为今后实现溶瘤病毒介导RNAi提供了实验依据.
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日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ-p15亚单位的分离和序列分析
目的分离和鉴定日本血吸虫(Schistosoma japonisum,Sj)新基因.方法应用表达序列标签(Expressed sequence tags,ESTs)法随机筛选Sj cDNA文库,通过PCR直接序列测定技术和同源性比较对阳性插入片段进行鉴定.采用亚克隆技术和生物信息学分析对日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录延长因子SⅢ-p15亚单位进行结构和功能的鉴定.结果我们从Sj cDNA文库中随机筛选到一个cDNA克隆,它含有一个371个碱基组成的阅读框,编码118个氨基酸,与哺乳动物等的RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ-p15亚单位具有较高的同源性,且具有该因子所特有的氨基酸序列,表明我们已经获得了日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ-p15亚单位.结论获得了日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ-p15亚单位的全长cDNA序列,为该基因功能的实验性鉴定工作奠定基础.
关键词： 日本血吸虫 RNA聚合酶Ⅱ 转录延长因子SⅢ-p15 序列分析 cDNA -
循环miRNA在疾病诊断中的应用
微小RNA(miRNA)是指长度为18～24个核苷酸的内源性小分子非编码RNA,普遍存在于各种生物中,由RNA聚合酶Ⅱ转录后,形成RNA前体分子(pri-miRNA),在细胞核内经 RNA酶Ⅲ( Drosha)和双链RNA结合蛋白(Pasha)加工成长约70个核苷酸,具有茎环结构的miRNA前体(pre-miRNAs),pre-miRNAs经exportin5等蛋白转运到细胞质中,在另一个RNA酶Ⅲ(Dicer)剪切下形成约22个核苷酸的miRNA双链,其中一条为成熟的miRNA分子.成熟的miRNA分子在细胞内与Argonaute蛋白等形成RNA诱导的基因沉默复合体RISC(RNA induced silencing complex),并倾向于保留在miRISC复合体中,对靶基因进行负调控[1,2].
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CDK9/Cyclin T(P-TEFb)及其生物学功能
细胞周期依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)家族目前已经发现9个成员(CDK1～CDK9),根据其功能分为两大类:控制细胞周期的CDKs和控制细胞转录的CDKs.CDK9即属于后者.CDK9是正性转录延长因子b(positive transcription elongation factor b,P-TEFb)中的催化亚基成分,通过磷酸化RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ)和一些负性转录延长因子从而使转录从起始部位得以延伸.cdk9/cyclinT的异常表达与很多疾病的发生有密切关系.Cdk9/CyclinT将给艾滋病和肿瘤等疾病的治疗提供颇有应用前景的作用靶点.
关键词： 细胞周期依赖性蛋白9 CDK9 正性转录延长因子b RNA聚合酶Ⅱ -
中介体复合物——RNA聚合酶Ⅱ转录装置的信息传递者
在真核通用转录装置与基因特异性调控蛋白之间起到桥梁作用的是-种保守的多蛋白中介体复合物(mediator complex).中介体复合物是由约20种蛋白组成的复合物,以单独或与RNA聚合酶Ⅱ形成复合物的形式存在,后者被定义为全酶(holoenzyme).中介体复合物把从增强子等调控区获得的正调控与负调控信息,经过整合和转换再传递到启动子.它直接通过RNA聚合酶Ⅱ行使功能,并在依赖于启动子的转录过程中调节RNA聚合酶Ⅱ的活性.近在哺乳动物转录系统中也发现了一些与酵母中介体复合物极为相似的类似物也能够与转录激活蛋白相互作用,并且在转录调节过程中起到重要的作用.
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Medl9基因与肿瘤关系的研究进展
中介体(Mediator)是真核生物转录起始过程中的基因特异调控蛋白和RNA聚合酶Ⅱ重要的转录组成部分,早发现于酵母菌中,是由多个蛋白质亚基组成的生物大分子复合物,属于RNA聚合酶Ⅱ通用转录装置的基本组分,在真核生物mRNA合成的活化和抑制中发挥关键作用,对RNA聚合酶Ⅱ活力进行调节.Med19基因在酵母中又名ROX3(或SSN7、RMRl等).初是在研究CYC7基因突变体中发现的.野生型ROX3基因的克隆序列表示,它编码一个220个氨基酸的蛋白质.Med19基因在人体又称肺癌转移相关蛋白(LCMR1),定位于染色体chr11q12.1,蛋白质244个氨基酸组成,基因全长1605 bp.Med19(Rox3)是中介体的一个亚单位,构成了酵母RNA聚合酶Ⅱ的头部组件,在转录激活和抑制中发挥重要作用.本文就Med19基因的特点、功能及其与肿瘤等关系的新研究进展作一综述.
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saRNA在转录水平激活人膀胱癌细胞p21WAF1/CIP1的表达研究
目的 探讨小激活RNA-dsP21-322上调人膀胱癌细胞系T24中抑癌基因p21WAF1/CIP1(p21)表达的效应.进一步分析dsP21-322是否还可上调p21前体mRNA的表达,以及增强RNA聚合酶Ⅱ蛋白与dsP21-322靶向的p21启动子区的联系.方法 合成靶向p21启动子区的小激活RNA序列dsP21-322及阴性对照(dsControl),并分别转染至T24细胞,RT-qPCR和Western Blot分别检测p21 mRNA、前体mRNA和蛋白表达的变化.ChIP检测RNA聚合酶Ⅱ蛋白与dsP21-322靶向的p21启动子富集的改变.结果 RT-qPCR和Western Blot结果显示,dsP21-322可以明显上调T24细胞系中p21成熟mRNA、前体mRNA及p21蛋白的表达,且与dsControl相比,差异均有统计学意义(P<0.001).此外,dsP21-322的转染可以明显增强RNA聚合酶Ⅱ蛋白与dsP21-322靶向的p21启动子区的联系.结论 dsP21-322上调抑癌基因p21表达是发生在转录水平的基因调控过程,这一特征的发现为后续RNA激活机制的研究提供了部分理论依据.
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真核生物RNA聚合酶Ⅱ的研究进展
真核生物的基因表达是一个复杂的过程,参与转录的RNA聚合酶和一些因子起主要作用.在真核生物的3种RNA聚合酶中,又以RNA聚合酶Ⅱ的作用大,它负责转录生成hnRNA和mRNA,对生物的多样性及生命的存在均有重要的意义.
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RNA聚合酶Ⅱ启动子SMP8在活化肝星状细胞中的活性
我们已往的研究已经证实,RNA聚合酶Ⅲ启动子(pol Ⅲ)载体表达的针对TGF β1的核酶,在体外能有效逆转活化HSC的生物学活性[1].但TGF β1是广泛存在于各种细胞中,并发挥重要生物学效应的细胞因子,因此不具组织和细胞特异性的pol Ⅲ启动子核酶表达系统,在抑制HSC活化的同时会影响到正常肝细胞或其他细胞的功能,这使得基因治疗肝纤维化变得困难.
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染色质相互作用研究进展
真核生物的染色体如何发生复杂构象变化并组织成复杂的高级结构,仍是一个研究热点.染色体的这些结构特征和构象变化可通过了解染色质位点间的相互作用,即利用染色体(质)构象捕获(3C)及其衍生技术,如4C、5C、Hi-C和ChIA-PET等技术来研究.利用这些技术,已得到一些有关染色质相互作用与基因表达调控和细胞核内染色体组织结构的重要信息.如利用ChIA-PET技术,发现雌激素受体、RNA聚合酶Ⅱ、CTCF等一些转录因子都参与了染色质的长程相互作用,并同时在基因组水平鉴定了特定细胞中的一些相应的有调控潜能的DNA元件及其可能的调控基因.利用Hi-C及其他3C衍生技术,不但表明染色体在细胞核内占据着不同的染色体领域,而且发现染色体上有次级结构域如染色体区隔和染色体拓扑联合域.随着相关技术的完善和更多数据的获得,分析和整合这些数据将对生物信息学家提出更高的要求,同时也可以帮助我们更进一步了解染色体三维构象变化在不同环境下的变化规律,以及在基因转录调控、DNA复制和修复等重要过程中的作用.
