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疱疹病毒UL15基因的研究进展
UL15基因在疱疹病毒科中高度保守,编码的pUL15在病毒DNA包装过程中具有重要作用.本文从UL15基因的序列特点,编码蛋白氨基酸的特点,基本功能以及与pUL6、pUL28、pUL33的相互作用等方面进行概述,以期为研究pUL15在疱疹病毒感染和复制过程中的作用提供一定参考.
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疾病基因克隆的策略及主要方法
目录一、定位克隆 (positional cloning) 策略 (一)家系连锁分析法 (二)等位基因共占法 (三)人群相关分析法 (四)cDNA筛选二、消减杂交 (subtractive hybridization) 策略 (一)消减杂交法和抑制性消减杂交法 (二)差示反转录PGR法和差异消减显示法 (三)代表性差异分析法和Sl核酸酶介导的缺失基因探针富集法 (四)基因组错配扫描法 (五)比较基因组杂交法 (六)DNA微阵列杂交系统三、两类策略的联系
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基因编辑技术成功精确修饰人类T细胞
《科技日报》报道,美国加州大学旧金山分校的研究小组利用基因编辑技术CRISPR/Cas9精确修饰了人类T细胞。由于T细胞在人体免疫系统中作用十分重要,这一研究成果将为治疗糖尿病、艾滋病及癌症等提供全新的手段。CRISPR/Cas9是新出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。新的方法能使T细胞表面一种称为趋化因子受体CXCR4的蛋白质失去功能。这种蛋白可被艾滋病病毒利用感染T细胞,进而引发艾滋病。在癌症免疫疗法中,科学家发现,新方法还可成功关闭PD?1分子,进而诱导T细胞攻击肿瘤。
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CRISPR系统中Cas蛋白的分类及作用机制
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统存在于40%细菌与90%古细菌中,由前导序列、回文重复序列、相关Cas蛋白三部分构成.Cas蛋白是CRISPR系统中的-类核酸酶,对CRISPR系统发挥获得性免疫功能具有重要作用.已鉴定出至少45个Cas蛋白家族,其多样性对现有分类系统提出了巨大挑战.不同类型的Cas蛋白在CRISPR系统适应、表达、干扰等作用阶段发挥的功能各异.本文主要讨论Cas蛋白的分类及作用机制的研究进展.
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CRISPR/Cas9基因编辑/修饰系统的应用研究进展
成簇、规律间隔短回文重复序列( clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关序列(CRISPR associated sequences,Cas)9基因编辑/修饰系统是源于细菌及古细菌中的一种后天免疫系统,其介导的基因编辑由向导RNA( guide RNA, gRNA)引导Cas9核酸酶对DNA进行切割[1]。
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1例上呼吸道感染病例的高通量测序病原鉴定
目的 以高通量测序技术对1例上呼吸道感染病例的可能病原进行鉴定并对样品前处理方法进行优化.方法 以核酸酶和/或核糖体RNA探针杂交预处理患者咽拭子样本,非序列依赖单引物扩增(sequence-independent single primer amplification,SISPA)后制备测序文库,利用MiSeq高通量测序,对测序结果进行生物信息分析及Real time RT-PCR验证.结果 测序reads经拼接后与病毒数据库比对发现存在乙型流感病毒序列,进化分析该毒株属于Yamagat系一株新的变种,核酸酶结合核糖体RNA探针杂交处理样本可提高高通量测序目标序列数及覆盖率.结论 应用核酸酶和/或核糖体RNA探针杂交处理样本结合高通量测序技术可用于快速高效地鉴定不明原因感染的病原.
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发酵支原体抗HIV-1作用机制的研究
目的研究发酵支原体抗HIV-1作用机制. 方法以发酵支原体PG18为实验菌株,制备支原体培养上清液和支原体菌体蛋白.用高效液相层析纯化发酵支原体PG18培养上清的蛋白,检测各部分逆转录酶抑制活性和核酸酶活性.用ELISA法检测发酵支原体对正常人PBMC及感染HIV-1的人PBMC分泌IL-10的影响及rhIL-10在体外对HIV-1复制的抑制作用. 结果发酵支原体PG18培养上清蛋白质相对分子质量(Mr)为(67~100)×103和(10~25)×103时,分别具有36%和34%的RT活性抑制作用和部分核酸酶活性.发酵支原体PG18菌体蛋白可显著诱导正常人PBMC及感染HIV-1的PBMC分泌IL-10,且对感染HIV-1的PBMC分泌IL-10的诱导活性更强.rhIL-10可抑制HIV-1在PBMC中的复制,并随剂量的增加而增强. 结论发酵支原体PG18培养上清的逆转录酶活性抑制作用和菌体蛋白对PBMC分泌IL-10的促进作用为发酵支原体PG18抗HIV作用的相关机制.
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功能性适体传感器应用研究进展
近年来,大量研究揭示了核酸的多种生物学功能形式,这些具有不同特性的核酸称之为功能性核酸(functional nucleic acids,FNAs),如天然存在的核酶[1]、反义RNA[2]和核糖开关[3];以及运用selex(systemic evolution of ligands by exponential enrichment)技术人工合成的适体[4-5]和变构核酸酶等.
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DNA损伤应答与DNA双链断裂修复
在多种多样的生物体中,基因组保持完整具有极为重要的意义,它是细胞发挥功能和维持生存的必要条件.但是许多内源或外源因素如电离辐射(IR)、基因毒性剂、复制叉停止、核酸酶、减数分裂、免疫细胞V(D)J基因重排等,均可引起DNA损伤,破坏基因组的稳定性.
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3’-端肽缀合修饰提高寡核苷酸的血清稳定性
RNA干扰被广泛用于传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域,但体内稳定性较差限制了其在临床上的应用.本文报道了在siRNA正义链的3端缀合不同长度的肽片段均能够明显提高血清稳定性,而在siRNA反义链的3'-端缀合相同的肽片段则对血清稳定性没有影响.血清中的RNase A能够选择性水解siRNA正义链3'-末端缀合的肽片段,从而得到原siRNA片段,但反义链3'-末端缀合肽缀合物则不能在血清中得到原siRNA片段.该结果进一步证明RNase A对siRNA双链的进攻具有方向性.
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分子病原体以氧化物媒介制造慢性病
在过去几十年里,慢性病包括癌症的病因学研究一直在探索基因改变是如何引起疾病的.自身免疫疾病和癌症的转移与氧化物的密切关系,慢性病相同的发展过程以及这些疾病之间的关系显示慢性病与一类特殊致病微生物有关.其中一种微生物造成一种特定疾病.这类微生物感染细胞,与细胞基因杂交而改变基因,并合成新的蛋白质.这些蛋白质诱发免疫反应进而制造疾病.这类病原体的发现使研究者对慢性病的病因有了进一步的认识,对预防和治疗慢性病具有重要意义.
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前列腺癌相关microRNA的研究进展
microRNA(miRNA)是近年来研究活跃的细胞调控因子.和传统的蛋白因子不同,miRNA是一种19到22个核苷酸之间的非编码RNA,能在转录和翻译水平上调控基因表达.其作用机理为:在细胞核内,miRNA基因经RNA聚合酶Ⅱ转录出具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的原初miRNA(pri-miRNA),pri-miRNA被核酸酶Drosha切断,生成70个核苷酸的具有茎环结构的miRNA前体(pre-miRNA).
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表面等离子共振检测金属表面不同相对分子质量的壳聚糖对质粒DNA的保护作用
目的 研究采用表面等离子共振(SPR)技术,检测不同相对分子质量壳聚糖对质粒DNA(pDNA)的保护作用,以防止核酸酶(DNase 1)的降解.方法 用具有羧基化葡聚糖表面的CM5芯片固定在Biacore3000生物大分子相互作用系统中制成壳聚糖芯片,采用SPR检测在核酸酶存在下,不同相对分子质量壳聚糖对pDNA的保护作用.结果 在人体温度(37℃)下,浓度5 U/μl的DNase I在1 min内即可降解没有保护的质粒DNA,而相对分子质量为200 000以上的壳聚糖对质粒具有良好的保护作用.结论 表面等离子共振技术可以作为体外研究金属表面高分子对于质粒DNA保护作用的一种新方法.
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氨基噻唑酮Cu(Ⅱ)核酸酶的合成、结构及活性研究
目的:探究氨基噻唑酮Cu(Ⅱ)核酸酶的合成、晶体结构及其活性,预期得到一种高效的体外化学核酸酶试剂.方法:利用单晶衍射、琼脂糖凝胶电泳分别确定氨基噻唑酮Cu(Ⅱ)核酸酶试剂的空间结构及其活性.结果:氨基噻唑酮Cu(Ⅱ)核酸酶试剂为单斜晶系,空间群为P2(1)/n,由单个[Cu(TZD)Br2] (1) (TZD=(Z)-3-methyl-2-((E)-(1-phenylethylidene)hydrazono)-thiazolidin-4-one)单元组成,相比原来配合物[Cu(4ML)Cl],经改造后的1在外界诱导剂的存在下30 μmol/L即可将DNA由FormⅠ完全转变为Form Ⅱ,核酸酶活性提高10倍以上,核酸酶机制以氧化切割为主.结论:该研究获得一种氨基噻唑酮配体和一个新颖的氨基噻唑酮Cu(Ⅱ)配合物,并表征其晶体结构,1作为一种高效的核酸酶试剂,其能力比[Cu(4ML)Cl]提高一个数量级,可作为一种潜在的抗肿瘤药物.
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抗核小体抗体的临床意义
核小体(nucleosome)是染色质的基本结构.染色质原纤维就像一条串珠,由紧密排列的核小体组成[1].核小体的核心是由8个带正电荷的组蛋白(histone)分子(H2A、H2B、H3和H4各2个分子)组成,呈扁圆形,它的直径约10 nm.DNA缠绕其上约1.75圈,长约140 bp,带负电荷.这种八聚体的复合物中,H3、H4位于中心,而H2A、H2B位于两侧,此结构对内源性核酸酶有抵抗,使之不被内源性核酸酶裂解.组蛋白富含碱性的精氨酸与赖氨酸,故能与酸性的DNA紧密结合.两个核小体之间由50~60 bp的DNA链与H1相连.
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抗双胸蚓核酸酶EWD2多克隆抗体的制备及鉴定
目的 将从双胸蚓组织中纯化的核酸酶EWD2免疫新西兰大白兔制备兔抗EWD2多克隆抗体.方法 将纯化的双胸蚓核酸酶EWD2免疫新西兰兔,制备兔抗EWD2血清,以Western Blotting和ELISA方法分析其特异性和效价.结果 EWD2蛋白免疫新西兰兔成功获得多克隆抗体.Western Blotting结果显示制备的抗体具有较高的特异性,ELISA显示效价为1∶6 000. 结论 获得了双胸蚓核酸酶EWD2多抗血清,为今后对双胸蚓核酸酶活性和结构的研究建立了基础.
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伴胰腺外分泌异常的糖尿病的认识及处理
胰腺是机体的一个重要器官,负责分泌消化外分泌液,也是分泌胰岛素等内分泌激素的器官.胰腺主要部分为腺细胞组成的外分泌部分,分泌大量的酶原颗粒[1],这些颗粒系含有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等的消化酶;胰岛散在的分布在外分泌腺组织中间.胚胎期,胰腺衍生于发育期的前肠内胚层,向外增生形成两个芽形突起;为背胰芽和腹胰芽[2],背胰芽形成包括胰头、全部胰体和胰尾的胰腺大部分及胰岛;腹芽形成后侧胰头,也含有少数散在的胰岛.
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端粒酶与肺癌诊断
1 端粒端粒是真核生物染色体末端的一段特殊结构,由DNA序列及相关蛋白质组成,该序列富含鸟嘌呤碱基G,具有种属特异性[1].人的端粒包括重复的5'-TTAGGG-3'序列,在体外形成发夹折叠的二级结构,为染色体末端提供了一个保护性的"帽子",防止染色体的异常重组、端-端融合及保护DNA不被核酸酶及连接酶所破坏等作用[2].通常细胞每分裂1次,端粒丢失约50~200个碱基对,这是由于DNA聚合酶不能完全复制线性DNA末端所致,端粒酶的存在和活化解决了这一末端复制的问题[3].随着染色体端粒的不断丢失,大多数正常体细胞逐渐丧失了分裂能力,当端粒缩短达到某一关键长度时将导致死亡,可见端粒的长度和稳定与细胞生命活动周期密切相关,被称为细胞寿命的"时钟".
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华西启动“基因剪辑”人体试验
7月21日,《自然》杂志官网发布消息称,今年8月,中国科学家有望开展全球首个CRISPR-Cas9基因编辑临床试验治疗肺癌,试验将由四川大学华西医院肿瘤学家卢铀教授及其研究小组进行,这一临床试验已于7月6日通过了医院审查委员会的伦理审批.CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御,可用来对抗入侵的病毒及外源DNA.CRISPR-Cas9基因编辑技术,是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术,是继“锌指核酸内切酶(ZFN)”“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”.与前两代技术相比,其成本低、制作简便、快捷高效的优点,让它迅速成为科研、医疗等领域的有效工具.
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多种方法结合去除冻干人用狂犬病疫苗中Vero细胞残留DNA
目的 采用多种方法结合去除冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞残留DNA.方法 采用滤芯(滤板)澄清、鱼精蛋白处理、核酸酶处理、Sepharose 4FF层析纯化或澄清、核酸酶、Sepharose 4FF层析纯化结合的方法去除Vero细胞培养的狂犬病病毒液中的Vero细胞DNA,检测Vero细胞DNA残留量、抗原含量、核酸酶残留量及疫苗效价.结果 0.45 μm UB玻璃纤维澄清病毒液,抗原损失率较小;鱼精蛋白去除Vero细胞DNA,抗原损失量较大;核酸酶处理后,病毒液中Vero细胞DNA残留量仍高于1 ng/ml;经Sepharose 4FF层析纯化,能有效去除浓缩后经核酸酶处理的病毒液中的核酸酶及一定量的Vero细胞DNA;采用多种方法结合去除病毒液中Vero细胞残留DNA,DNA残留量<100 pg/ml,疫苗效价≥4.0 IU/ml,均达到《中国药典》三部(2010版)要求.结论 多种方法结合能有效去除冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞DNA残留量,且疫苗效力达到《中国药典》三部(2010版)要求.