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利用GoPubMed对CRISPR相关文献的计量学分析
为了解CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)相关研究现状,笔者采用GoPubMed数据库的在线分析软件,对CRISPR相关文献进行计量分析.共检索到文献758篇.CRISPR相关研究文献呈逐年上升趋势,其中美国在CRISPR的文献数量和影响力均居首位,中国以北京地区发表文献多(30篇).PLoS One刊登相关文献47篇,占发表总量的6.20％,居首位.CRISPR研究主题词涉及基因、基因组学、免疫等.高产作者为Horvath,共发表CRISPR相关文章11篇.利用GoPubMed可较好反映CRISPR研究的现状和发展趋势.中国CRISPR研究文献在整体质量和数量上均有待进一步提高.
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SNP位点rs6858698对慢性淋巴细胞白血病易感性的影响
目的 探讨rs6858698位点的功能活性及其对慢性淋巴细胞白血病易感性的影响.方法 双荧光素酶报告基因系统检测含有rs6858698位点的DNA片段的调控活性.利用CRISPR/Cas9系统在HEK293T细胞内构建点突变的稳定细胞株.全转录组测序分析(RNA-seq)不同基因型的细胞株之间的基因表达差异情况.并用实时定量PCR(RT-qPCR)和CRISPR干扰实验(CRISPRi)对RNA-seq的结果进行验证.结果 rs6858698-C DNA片段的调控活性约是rs6858698-G DNA片段的调控活性的1.69倍.转录组测序分析在两种基因型的细胞中共鉴定出140个差异表达的基因(P<0.05),其中有87个基因表达下调,53个基因表达上调.差异表达基因主要富集在9个生物学过程.RT-qPCR和CRISPRi实验的验证结果与RNA-seq的结果一致.结论 SNP位点rs6858698具有调控功能,可以通过影响与表观修饰相关的基因的表达,进而影响个体对慢性淋巴细胞白血病的易感性.
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CRISPR系统中Cas蛋白的分类及作用机制
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统存在于40％细菌与90％古细菌中,由前导序列、回文重复序列、相关Cas蛋白三部分构成.Cas蛋白是CRISPR系统中的-类核酸酶,对CRISPR系统发挥获得性免疫功能具有重要作用.已鉴定出至少45个Cas蛋白家族,其多样性对现有分类系统提出了巨大挑战.不同类型的Cas蛋白在CRISPR系统适应、表达、干扰等作用阶段发挥的功能各异.本文主要讨论Cas蛋白的分类及作用机制的研究进展.
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基于CRISPR-Cas9定向编辑CCL17和CCL22基因的研究
目的 针对人源的CCL17和CCL22基因进行CRISPR/Cas9-gRNA设计,并验证设计的sgRNA的有效敲除效率.方法 利用CRISPR网站提供的工具对CCL17和CCL22基因的靶向编辑位点进行筛选设计,然后构建CRISPR-Cas9-CCL17和CRISPR-Cas9-CCL22敲除质粒,并将构建好的质粒转入293 T细胞系,然后通过基因组PCR产物的T-A克隆测序方法分别验证设计的sgRNA敲除质粒的编辑效率.结果 成功构建针对于人源CCL17和CCL22基因的sgRNA敲除质粒,并有着良好的编辑效率,均达70％以上.结论 针对CCL17和CCL22基因设计的CRISPR敲除质粒对靶基因有着很好的编辑效果,为后续基于CCL17和CCL22的相关性研究奠定了基础.
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CRISPR-Cas系统在生物学研究中的应用
成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,简称为CRISPR)系统是一种新的基因修饰技术,具有制作周期短、成本低和作用高效等优点.本文从结构、研究历史、分类和分布、作用机制和其在生物学研究中的应用等方面介绍CRISPR-Cas系统.
关键词： CRISPR CRISPR-Cas系统 生物学研究 -
基因编辑在艾滋病治疗中的研究进展
随着HIV病毒学研究的不断深入,传统抗反转录病毒治疗在HIV病毒清除和疾病治愈中的局限性日益凸显,因此通过基因编辑达到HIV病毒控制甚至完全治愈的策略倍受重视.目前基因编辑的研究主要包括以下两个方面:RNA水平的编辑技术和DNA水平的编辑技术.近年来包括锌指核酶技术(zinc finger nucleases,ZFN),转录激活样效应因子技术(transcription activatorlike effector nucleases,TALEN),成簇规律间隔短回文重复序列技术(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat, CRJSPR)和NgAgo-gDNA技术在内的DNA编辑技术进展迅猛,并在HIV治疗中取得了长足的发展.本文比较了不同DNA水平编辑方法的特点和差异,综述了新一代基因编辑技术在HIV治疗中的进展以及潜在的医学应用前景.
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CRISPR药物递送系统的研究现状及发展趋势
CRISPR (clustered regularly interspersed short palindromic repeats)是一种新型基因编辑技术,可以通过对基因进行精准修饰来达到治疗肿瘤、艾滋病等疾病的目的.然而,基因药物存在不稳定、易降解、入胞能力差等问题,限制了CRISPR技术的应用.因此,需要寻求合适的递送系统,将药物有效地递送至靶细胞中,进而提升CRISPR技术的效率及特异性.本文主要综述了近年来CRISPR技术的药物递送系统的研究进展,对病毒载体和非病毒载体的优势、劣势,研究现状及发展趋势等进行总结和阐述,为各类药物递送系统在生物医药治疗领域的应用提供参考.
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高分辨率熔解曲线在CRISPR基因编辑检测和基因型鉴定中的应用
目的 建立一种基于PCR和在线高分辨率熔解曲线(high-resolution melting curve,HRM)分析工具的检测方法,实现对DNA序列微小差异的快速检测.方法 在CRISPR基因编辑检测和基因型鉴定中,采用两步PCR,分别对目的片段进行扩增和富集,并通过免费在线软件对HRM进行分析.结果 HRM分析结果显示,本实验所设计的CRISPR慢病毒系统未能对COS7细胞中的RPE65基因进行有效的基因编辑;而在瘦素突变大鼠的子代基因型中,HRM可以明显区分杂合子和纯合子.结论 HRM能够快速鉴定CRISPR编辑和区分基因型.
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四川省鼠疫耶尔森菌CRISPR基因分型及地区分布研究
目的 对四川省鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)做规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats CRSIPR)基因分型和地区分布研究,为四川鼠疫防治提供科学依据.方法 对132株鼠疫菌培养和提取核酸,应用3对CRISPR引物对被试菌株DNA进行PCR扩增、测序和分析,确定四川省鼠疫菌的CRSIPR基因型.结果 132株鼠疫菌共发现17种spacer,包括YPa 9种、YPb 5种、YPc 3种,新发现的1种space阵列.所有鼠疫菌株被分为2个CRISPR基因簇(Cc3',Ca7),3个基因型(37'型、22型和sc01型).其中石渠县青海田鼠型菌株基因型为37'型,石渠县人间鼠疫的菌株为22型,德格县旱獭型菌株基因型为22型,巴塘县、理塘县、雅江县和新龙县旱獭菌株基因型为sc01型.结论 四川省鼠疫菌菌株具有明显的地区分布特征.
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CRISPR及其在原核生物防御系统中的作用
近来在众多原核生物的基因组中,人们发现一类成簇的、有规律间隔的短回文重复序列(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)结构家族.CRISPR由一类DNA重复单元构成,在功能上与DNA的重组、修复及原核生物的免疫防御系统关系密切.通过对CRISPR和其相关系统(CASS)基因的比较性分析,CRISPR独特的结构和功能引起人们的广泛关注.实验表明CASS的插入序列来源于细胞内的许多染色体外遗传物质,并且以一种类似于真核生物中:RNA干扰(RNAi)系统的机制,在原核生物抵抗入侵的噬菌体和质粒的防御系统中发挥着重要作用.本文对CRISPR的结构、片段来源和功能进行综述.
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CRISPR-Cas9基因编辑技术在乙肝病毒感染治疗中的应用
目的 探讨CRISPR-Cas9基因编辑技术在乙肝病毒感染治疗中的应用.方法 构建CBFβ表达载体,根据从HepG2细胞中提取的RNA,反转得到cDNA,设计CBFβ引物扩增目的基因,连接,转化,挑取阳性克隆,通过PCR鉴定及酶切鉴定,测序进一步鉴定.结果 获得了稳定敲除CBFβ的HepG2细胞系及稳定表达的CBFβ真核表达载体.结论 CRISPR-Cas9技术可有效清除感染细胞内基因组,对于乙肝的治疗意义重大,值得推广.
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基于CRISPR-Cas9定向编辑TRAC基因的研究
目的 针对人源TCRα C基因(TRAC)进行CRISPR/Cas9-gRNA的设计,并验证设计的gRNA的有效性及其脱靶率.方法 利用CRISPR网站(http://crispr.mit.edu/)提供的靶向编辑位点筛选工具,针对TCRα C区各设计出了3个编辑位点,并据此构建CRISPR-Cas9-TCR敲除质粒,将构建好的质粒转染293T细胞系,通过流式细胞术结合PCR产物的T-A克隆测序等方法验证各个gRNA序列的编辑效率.再根据所预测的潜在脱靶位点,设计相应的上下游引物进行PCR扩增后测序,检测其是否出现脱靶.结果 在3组针对TCRα C区的gRNA中,site2-gRNA的编辑效率高,并且无脱靶现象.结论 针对人源TCRα C基因设计的site2-gRNA对TCRα C区具有很好的编辑效果,且无脱靶现象,为消除杂合TCR分子的产生和改善TCR修饰的T细胞(TCR-T)过继性免疫治疗奠定了基础.
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应用双靶标CRISPR慢病毒载体在间充质干细胞中稳定敲除lncRNA DANCR基因
[目的]应用CRISPR/Cas9方法,构建特异性靶向长链非编码RNA DANCR基因两端的双靶标慢病毒载体,稳定敲除间充质干细胞(MSC)中的DANCR基因,为研究DANCR的生物学功能奠定基础.[方法]首先设计靶向DANCR的5'和3'端的sgRNA (single-guide RNA),转染293FT细胞,提取293FT细胞基因组DNA,验证靶向序列的有效性.然后通过gateway和酶切连接的方法,将分别靶向5'和3'端的两条有效sgRNA序列连接至同一慢病毒CRISPR载体.终使用293FT进行慢病毒包装,收获病毒感染MSC,检测MSC中DANCR敲除效率.[结果]在证明靶向DANCR基因两端的sgRNA序列均单独有效的基础上,将靶向5'和3'端的sgRNA进行组合,成功构建靶向DANCR的双靶标慢病毒载体.将载体进行慢病毒包装后感染MSC,成功获得DANCR敲除的MSC.[结论]应用CRISPR方法成功构建敲除DANCR的慢病毒载体,能高效稳定地敲除MSC中的DANCR基因.
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CRISPR/Cas9技术在HepG2基因组中进行定点基因突变的探索
目的：探索利用CRISPR/Cas9技术在细胞株HepG2基因组中进行定点突变。方法设计并构建靶向核受体LRH-1和ERRα基因组序列的gRNA质粒。将构建好的gRNA质粒和hCas9质粒转染HepG2细胞后，PCR扩增HepG2基因组中LRH-1和ERRα基因的突变位点，并用SURVEYOR法检测突变情况。结果靶向核受体LRH-1和ERRα基因组序列的gRNA质粒构建成功。HepG2细胞经gRNA-LRH-1/gRNA-ERRα和hCas9转染后，针对LRH-1和ERRα的突变位点基因组序列的PCR产物经SURVEYOR法检测结果显示出现两条与预计大小相符的电泳条带。结论在HepG2细胞中成功利用CRISPR/Cas9技术介导的基因组编辑对LRH-1和ERRα特定基因组序列产生突变，为构建其细胞株敲除模型奠定了基础。
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CRISPR/Cas9基因剪辑技术在乙型肝炎病毒感染治疗中的应用
CRISPR/Cas9基因剪辑技术源于细菌及古细菌CRISPR介导的后天获得性免疫系统,通过引导RNA与靶DNA PAM序列特异性识别,引发Cas9核酸酶定点切割互补双链DNA,在基因剪辑方面具有制备简单、剪辑位点特异性高及易于同时剪辑多个基因位点等优势,已被广泛应用于哺乳动物细胞基因剪辑.本文主要从CRISPR/Cas9技术作用原理和其抗乙型肝炎病毒感染作用及机制等方面进行综述.
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志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列的相关基因检测
目的 建立检测志贺菌CRISPR相关基因的斑点杂交方法.方法 分别采用PCR法制备地高辛标记DNA探针和人工合成的寡核苷酸探针,与志贺菌CRISPR相关基因进行斑点杂交.结果 设计出志贺菌CRISPR的相关基因探针;实现了志贺菌CRISPR系统的探针制备及杂交方法的建立.结论 斑点杂交可以快速大量检测志贺菌CRISPR的相关基因.
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利用比较基因组学快速鉴定大肠埃希菌噬菌体耐受基因
噬菌体是解决致病菌多重耐药性问题的佳选择之一,然而噬菌体的宿主特异性使得噬菌体的裂解谱有限,因此研究噬菌体宿主特异性对于噬菌体治疗应用具有重要意义.本研究通过筛选大肠埃希菌宿主菌BL21噬菌体IME253的耐受菌,结合对敏感菌和耐受菌的高通量测序,分析基因组差异,预测噬菌体耐受相关基因,发现耐受与外膜受体蛋白FepA有关.然后利用向导CRISPR/Cas9切开敏感菌epA基因,同时利用Red同源重组系统无痕敲涂fepA基因,证明fepA基因敲除可以导致细菌BL21对噬菌体IME253耐受.本实验利用比较基因组学分析平台,建立了一种宿主耐受噬菌体的分析方法,并且利用CRIPSR无痕敲除技术来验证耐受相关基因,为噬菌体治疗提供理论基础.
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CRISPR/Cas9技术应用的研究进展
成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是存在于细菌和古细菌中的获得性免疫系统,通过其转录产物crRNA(CRISPR RNA)及CRISPR相关蛋(CRISPR-associated,Cas),尤其是Cas9蛋白特异性抑制入侵的DNA.该系统由于其快捷靶向以及其作为一种特定位点核酸酶的高效性和多重修饰的可能性,被广泛应用于基因编辑领域.本文主要从CRISPR/Cas9系统的相关概念及原理、技术研究进展、应用研究进以及CRISPR/Cas9技术应用的未来发展进行阐述.
关键词： CRISPR CRISPR/Cas Cas9 基因编辑
