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疾病基因克隆的策略及主要方法
目录一、定位克隆 (positional cloning) 策略 (一)家系连锁分析法 (二)等位基因共占法 (三)人群相关分析法 (四)cDNA筛选二、消减杂交 (subtractive hybridization) 策略 (一)消减杂交法和抑制性消减杂交法 (二)差示反转录PGR法和差异消减显示法 (三)代表性差异分析法和Sl核酸酶介导的缺失基因探针富集法 (四)基因组错配扫描法 (五)比较基因组杂交法 (六)DNA微阵列杂交系统三、两类策略的联系
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肝癌相关cDNA片段的快速克隆和表达
目的:克隆原发性肝癌相关新基因.方法:利用抑制消减杂交法(suppression subtractive hybridization,SSH)已经发现了1条新的肝癌相关基因片断表达序列标签(EST),长447 bp,经Genebank检索,90%无同源性.在其保守序列区设计了2条用于3'Race扩增的寡聚核苷酸引物(3'GSP2:5'-CGCATAGTACCAGTATCGAC AAAGG-3',3'NGSP2:5'-TCCACATTACGGACC CGACGGATT-3'),利用cDNA末端快速扩增法(RACE)进一步克隆该基因的全长cDNA序列.人原发性肝癌细胞株HepG2,体外传代培养,培养基为RPMI1640培养基.提取HepG2总RNA,方法参照SV Total RNAIsolation System 的说明进行.RACE法扩增采用Clontech公司的Smart TM Race cDNA Amplification Kit.将3'RACE-PCR扩增的目的片段以Race自带的产物纯化试剂盒进行纯化、回收,然后将其克隆到PMD18-T Vector中,提纯质粒后进行酶切鉴定,确认质粒内有插入片段,由宝生物工程(大连)有限公司协助完成测序,将克隆所得cDNA片段用NCBI提供的BLASTN与GeneBank与dbEST、 nr数据库进行同源性比较,确认代表新基因的EST并且登录GeneBank(http://www.ncbi.nlm.nih.GOV/submission).3便病理标本取自西南医院肝胆科,病理证实均为原发性肝细胞肝癌,分别提取肝癌及远端正常肝组织总RNA.将酶切回收的克隆插入片段分别进行同位素标记获得cDNA探针,利用Clontech公司的 ExpressHYBTM杂交液通过RNA印记法检测克隆片段在肝癌及正常肝组织中的表达,方法参照ExpressHYBTM Hybridization Solution user manual说明进行.同时,利用一联网的基因表达分析序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE(series analysis of gene expression,SAGE)对基因的表达及其表达水平进行分析,从而确定其组织分布.结果:得到5条3'EST(694 447-3,724 447-3,697 447-3,711 447-3 692 447-3;大小500-550bp),5条3'EST均为登录GenBank(登录号:CK730344,CK730345,CK730346,CK730347,CK730348).对其中2条带有poly-A尾的3'EST(694 447-3 724 447-3)进行序列分析后,发现他们是代表新基因或不同剪接体的EST,且具有共同的保守序列.RNA印记分析显示694 447-3,724 447-3在3例肝癌组织中的表害强度时显高于对应的正常组织.通过SAGE文库分析基因的表达谱,发现694 447-3和724 447-3在神经系统肿瘤、结肠癌、胃癌、乳腺癌肿瘤文库的表达高于对应的政党组织文库.结论:克隆所得的2条带有poly-A尾的3'EST可能是新的肝癌多期因家庭成员.利用RACE技术可以快速、高效的克隆疾病相关基因.
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癌特异性的细胞凋亡诱导因子MDA-7/IL-24的研究进展
黑色素瘤分化相关基因7(melanoma differentiation-associated gene-7,MDA-7)初是由Jiang等[2]利用消减杂交法从β干扰素(IFN-β)和瑞香素(MEZ)诱导的终末分化人类黑色素瘤细胞中克隆到的基因.后来根据其结构序列的同源性,染色体的定位及类细胞因子的特点,被国际人类基因组织(HUGO)重新命名为IL-24.MDA-7/IL-24位于人类染色体的1q32-33,这是一个跨越195kb的基因组区,表达包括IL-10、IL-19、IL-20和IL-24等IL-10细胞因子家族.
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123恶性疟原虫:用定向标记消减杂交法获取富集子孢子特异转录本的cDNA文库
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老年性白内障与正常晶体上皮细胞中差异表达基因的筛选
目的: 筛选老年性白内障与正常晶体上皮细胞的差异表达基因.方法: 利用改良消减杂交法获得差异cDNA,利用PCR法扩增其中大片段差异cDNA,将其克隆入质粒载体,通过反向点杂交排除假阳性克隆后,阳性克隆测序与GenBank中的序列进行比较,新序列进行计算机分析.结果: 在文库中随机挑选约600个克隆酶切鉴定,获得≥750 bp片段400个.经反向点杂交,排除假阳性克隆后,共得到阳性克隆150个;测序的50个片段中,有30个已知基因(包括20个功能已知基因、10个序列已知但功能未知基因),3个新序列.新序列中有一个的氨基酸序列与假想的锌指蛋白有45%同源性,可能参与细胞生长调控与代谢.结论: 改良消减杂交法可以快速有效地获得老年性白内障差异表达基因,对稀有基因及新基因的发现与功能鉴定有重要意义.