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功能性单核苷酸多态性调控结核病易感的分子机制研究
目的 通过构建花生四烯酸12-脂氧合酶(ALOX-12)基因(ALOX-12基因)启动子区域rs3840880位点不同基因型的双荧光素酶表达质粒,分析此单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)对ALOX-12基因启动子活性的影响及其对基因表达的影响,阐明功能性SNP调控结核病易感的分子机制.方法 从全血样本中提取人全基因组,PCR扩增ALOX-12基因启动子区域包含rs3840880位点在内的约1700 bp的基因片段,构建pGL3-Basic-rs3840880G质粒,对此质粒进行定点突变得到pGL3-Basic-rs3840880 D放散型(DEL)质粒,分别转染人宫颈癌细胞株Hela细胞后使用双荧光报告酶检测系统(dual luciferase assay system)检测相对荧光值.结果 成功构建了ALOX-12基因启动子区rs3840880位点等位基因G的表达质粒pGL3-basic-G,采用定点突变技术成功将pGL3-basic-G质粒改造为pGL3-Basic-DEL质粒,测序验证后,两质粒其他序列完全相同.分别将此两个质粒转染Hela细胞并检测相对荧光比值[荧光值(F)/荧光?]后,发现pGL3-Basic质粒F/R=0.129,等位基因G的F/R=0.194,低于等位基因DEL质粒的F/R(0.274),采用单因素方差分析,二者之间的差异有统计学意义(F=25.09,P=0.001).结论 不同等位基因构建的质粒转染细胞后,荧光报告基因的表达差异具有统计学意义,故ALOX-12基因启动子区域的功能性SNPs确实能够影响启动子的活性,从而调控结核病的易感性.
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断续流动氢化物原子荧光法同时测定聚合氯化铝中的砷和汞
[目的]双道同时测定水处理剂聚合氯化铝中砷(As)和汞(Hg).[方法]以盐酸溶解样品,硫脲-抗坏血酸作掩蔽剂,氢化物发生原子荧光法同时检测.[结果]水处理剂聚合氯化铝中As含量为0.32mg/kg,Hg为0.0039mg/kg;As检出限0.037ng/ml,Hg检出限0.0043ng/ml;加标回收率As在96.5%～103.2%,Hg在82.7%～105.6%之间,试验了金属离子的干扰及消除.[结论]此法具有操作简便快速,灵敏度高,检出限低,线性范围宽,能够同时检测双元素,适于日常大批水处理剂等样品的检测.
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食品中总砷测定前处理条件对结果的影响
目的 探索试样前处理过程中,赶酸条件控制的优化,试验用容器具中被测元素本底残留对原子荧光光度法检测痕量砷的污染权重放大效应.方法 采用湿消解法和微波消解法,在不同条件赶酸,用氢化物原子荧光光度法检测标准物质小麦粉中的砷含量,并与标准值比对.结果 试样前处理赶酸是否规范,将直接影响检测结果的准确性.被测元素本底污染权重放大作用,使检测结果高出标准值可信范围.结论 严格按照消解采用的酸的沸点控制赶酸温度,标准物质检测值在标准值可信范围.
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荧光光度法测定芦荟胶囊中芦荟甙的含量
为建立方便可靠的芦荟甙测定方法,以监督芦荟类保健食品的质量,利用在硼砂介质中芦荟甙能与硼砂发生化学反应,使体系荧光强度大幅度提高的特点,采用荧光光度法对芦荟胶囊中芦荟甙含量进行了测定.方法的平均加标回收率为98.0%,相对标准偏差为2.7%.该法经济、准确、快速,能够用于芦荟类保健食品中芦荟甙的测定.
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用于氯霉素、克伦特罗和雌二醇三种兽药残留检测的高通量悬浮芯片技术研究
目的 建立一种氯霉素、克伦特罗和雌二醇(17-beta-estradiol,E2)的3种兽药残留的新型高通量悬浮芯片检测技术.方法 合成3种兽药的牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)结合物,并进行紫外和质谱鉴定.将3种蛋白结合物偶联于聚苯乙烯荧光微球上,在液相反应体系中3种小分子兽药抗原和微球上的结合物共同竞争液相中各自特异性的生物素化单抗,优化和筛选出微球上偶联BSA结合物和反应抗体的适加入量.绘制出3种兽药残留检测的标准曲线;对不同浓度的干扰物和待测物分组,以此进行特异性检测和盲样测定.并用扫描电子显微镜(简称电镜)进行微球表面微观结构观察.结果 3种小分子兽药可与BSA成功偶联;3种结合物的加入量和抗体的加入量分别做了优化;悬浮芯片检测的标准曲线方程和方程相应的决定系数(R2)表现良好,R2>0.99;3种兽药悬浮芯片的检测区间分别为(40.00～6.25)×105ns/L,(50.00～7.81)×105ng/L和1.00×103～7.29×105ng/L;低检出限为:40 ng/L、50 ng/L和1 μg/L;同时,悬浮芯片的特异度测试良好,与其他药物无明显交叉反应;对盲样测定的检测浓度值与实际浓度偏差在8.09%～17.03%,可认为偏差较小.电镜对微球表面微观结构的观察也直观地确证了蛋白在微球上的成功偶联.结论 高通量悬浮芯片技术操作简单,灵敏快速,成本低廉,为多种兽药残留的快速检测提供了新方法,具有广阔的应用和发展前景.
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阳和汤对骨关节炎软骨细胞HIF-1αmRNA影响的实验研究
目的:通过检测阳和汤对骨关节炎(OA)软骨细胞缺氧诱导因子-1αmRNA (HIF-1αmRNA)表达的影响,探讨阳和汤改善OA软骨退行性变的机制.方法:30只新西兰大白兔随机分为正常组、模型组、阳和汤组,每组10只,按照Hulth法建立的膝骨关节炎模型,分别对关节软骨病理切片后采用Safranin O染色,光镜下观察,进行Mankin评分,同时实时荧光定量PCR检测HIF-1αmRNA在各组的表达.结果:正常对照组Safranin O染色的Mankin评分与模型组差异有统计学意义(P=0.005),阳和汤组Safranin O染色减少或缺失程度较模型组轻,差异有统计学意义(P=0.003).模型组HIF-1αmRNA表达较正常组明显高,差异有统计学意义(P=0.035),阳和汤组HIF-1αmRNA表达明显低于模型组,差异有统计学意义(P=0.039).结论:阳和汤可延缓关节软骨退行性变,其作用可能是通过调控HIF-1αmRNA的作用.
关键词： 骨关节炎 中药疗法 荧光光度测定法 HIF-1αmRNA -
HBV-DNA荧光定量检测在原发性肝癌患者中的应用价值
目的:检测原发性肝癌(PHC)146例血清中乙型肝炎病毒(HBV)DNA拷贝数,进一步研究HBV感染与PHC关系.方法:用ELISA法检测PHC146例血清中HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb;同时采用荧光定量PCR法(FQ-PCR)定量检测其血清中HBV-DNA含量.结果:146例PHC中HBVM总感染率达90.41%(132/146),HBV-DNA总阳性率为56.85%(83/146),平均HBV-DNA拷贝数为105.36±1.32/ml.在HBVM各模式组中,小三阳组的病例多占47.95%(70/146),HBV-DNA阳性率为71.43%,平均HBV-DNA拷贝数为105.05±1.22/ml;大三阳组例数较少(7/146),而HBV-DNA阳性率高(100%),平均HBV-DNA拷贝数亦高达107.02±1.45/ml.结论:本研究发现HBV感染与PHCS发生关系密切,HBeAb的存在与PHC之间有相关性,而HBcAb的持续阳性亦可能是PHC的促发因素之一.
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一种改进的荧光定量PCR标准曲线法的建立
目的 对常规实时荧光定量PCR(RT-PCR)的标准曲线法进行改进,以建立一种更为准确的RT-PCR的标准曲线定量法.方法 通过构建β-actin、KLK11的质粒DNA标准品,以β-actin质粒DNA为正常对照,制作内参基因和目的 基因的标准曲线,获得各自的扩增曲线.RT-PCR检测两种基因在恶性前列腺组织细胞LNCAP中的表达,并将改进的标准曲线法与常规的标准曲线法分别对β-actin/KLK11实时定量PCR的结果进行分析,分析两种方法的差异,以衡量新方法的准确性.结果 所得β-actin和KLK11的标准曲线线性相关性良好(β-actin R2=0.991,KLK11R2=0.992),但两种基因的扩增效率有差异(β-actin 123%,KLK11 99%).两种不同的标准曲线法处理后得到不同的结果:常用标准曲线法结果显示KLK11在LNCAP中有表达下调,而改进的标准曲线法得出KLK11在LNCAP中上调4.46倍.目的 基因与内参基因的扩增效率差异有统计学意义(t=4.829,P＜0.05).结论 与常规的绝对定量法比较,改进的标准曲线法避免了因默认目的 基因与内参基因有相同的扩增效率而导致的错误,是一种更为准确的荧光定量PCR分析方法.
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三磷酸腺苷生物荧光法检测肿瘤药敏的价值
目的:探讨三磷酸腺苷生物荧光法(ATP-TCA)评估肿瘤药物敏感性和指导术后化疗的价值.方法:以ATP-TCA法在体外分别检测了59例5种实体瘤细胞对6种化疗药物的耐药率和敏感率.结果:5-FU、MMC、DDP等6种常用化疗药物的耐药率＞75%.胃肠肿瘤的化疗药物敏感性差异无显著意义,泰素、羟基喜树碱、丝裂霉素和吡柔比星对肝癌的敏感率分别为91.7%、60.0%、50.0%和42.8%;诺维本、博莱霉素对食管癌敏感率为85.7%、42.9%.结论:ATP-TCA法用于检测肿瘤化疗药物敏感性较为可靠,可作为指导实体瘤术后序贯性化疗的药物筛选手段.
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实时荧光定量聚合酶链反应检测解脲脲原体、沙眼衣原体感染
目的采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术,准确定量检测待检标本中解脲脲原体(Uu)、沙眼衣原体(Ct)的感染状况.方法采用实时FQ-PCR技术,检测标本650份;用常规PCR技术和实时FQ-PCR技术,对比检测了60例.结果FQ-PCR检测的650份标本,Uu-DNA、Ct-DNA检出率分别为24.08%(150/650)、16.00%(104/650),总检出率为36.00%(234/650).常规PCR结果重复检测时,14例Uu阳性者中2例变为阴性,而46例阴性者中3例变为阳性;10例Ct阳性者中1例变为阴性,而50例阴性者中2例变为阳性;FQ-PCR结果重复检测时完全吻合.结论实时FQ-PCR是检测Uu、Ct一个较好的方法.
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重视自发荧光检测技术在眼底疾病诊断中的应用
目前检查眼底疾病的方法较多,包括荧光素眼底血管造影(FFA),吲哚氰绿脉络膜血管造影(ICGA)及相干光断层扫描(OCT)等,这些检查技术均已在国内外眼底疾病的诊断中被广泛应用.近十年来,国外对眼底自发荧光检测技术在眼底疾病诊断中的价值十分关注,但在我国尚未引起重视,其原因可能与对自发荧光产生的机制和临床意义认识不足有关.为了使国内眼科医师充分认识自发荧光检测技术在眼底疾病中的诊断价值,笔者在阐明自发荧光产生机制的基础上,着重指出自发荧光是一种非侵入性、有发展潜力的眼底成像检测技术,其对多种眼底疾病的早期诊断、病情监控及预后评估等均具有较高的临床应用价值,因而需引起我国眼科医师的高度重视并逐步推广和普及.
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茴香酸荧光分析法测定血清中黄芪甲甙
目的：建立血清中黄芪甲甙含量的荧光分析法。方法：利用茴香酸在硫酸介质中与黄芪甲甙反应产生强烈荧光的特性，测定血清中的黄芪甲甙。结果：黄芪甲甙与茴香酸的反应产物的大激发波长为Ex=320 nm，大发射波长为Em=387 nm。黄芪甲甙在0.2～40. 0 mg*L －1范围内呈线性关系。低检出限为0.02 mg*L －1。测定样品的回收率为98.8 %～102.4%。结论：本文所叙述的荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、检出限低、无干扰等优点，尤其适于血清中微量黄芪甲甙含量的测定。
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香草醛-磷酸体系荧光分光光度法测定黄芪甲甙
目的:建立香草醛-磷酸体系荧光分光光度法测定黄芪甲甙的方法.方法:利用在磷酸条件下香草醛与黄芪甲甙的荧光反应测定黄芪甲甙.结果:黄芪甲甙与香草醛的反应产物的大激发波长Ex=365 nm,大发射波长Em= 430 nm.黄芪甲甙在0.0～20.0 mg.L-1范围呈良好的线性关系,低检测限为0.106 mg.L-1,测定样品的回收率为95.97%～102.1 %.结论:本方法具有灵敏度高、检测限低、直接测定无干扰等优点.测定黄芪口服液、中药复方补阳还五汤及含药猪血清等多种类型样品中的黄芪甲甙含量,结果满意.
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贲门癌自体荧光的实验研究
目的 探讨贲门癌组织显微自体荧光特征及作为自体荧光成分的Ⅲ、Ⅳ型胶原在贲门癌组织与正常胃组织中分布的不同.方法 采用激光扫描共聚焦显微镜以氩离子(Ar+)激光(Ex=488 nm)和氦氖(He-Ne)激光(Ex=543 nm)为激发光的双通道法对20例贲门癌手术标本进行自体荧光图像分析;采用免疫组化技术,半定量计分法分析Ⅲ、Ⅳ型胶原在正常胃组织和贲门癌组织中的分布差异.结果 贲门癌组织自体荧光信号与正常胃组织各层相比均显著减弱(P＜0.01).正常胃组织的Ⅳ型胶原抗体反应呈强阳性,贲门癌组织则明显减弱;而Ⅲ型胶原在贲门癌间质中的抗体阳性反应较正常胃组织变化不明显.结论 贲门癌组织与正常胃组织的显微自体荧光无论在形态、颜色、分布,还是在荧光强度上都存在巨大的差异.贲门癌组织比正常胃组织细胞外基质内Ⅳ型胶原显著减少,而Ⅲ型胶原减少不明显;Ⅳ型胶原可能是胃底贲门黏膜细胞外基质自体荧光的主要来源.
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水中砷、汞的双道原子荧光测定法
目的探讨水中砷、汞的双道原子荧光测定法.方法酸性条件下,砷、汞能同时与新生态氢气生成氢化物,采用氢化物原子荧光光度法进行测定,砷、汞灯电流均为80 mA,砷的主-辅电流之比为50:30,采用1%硼氢化钾的0.2%氢氧化钠溶液作为还原剂.结果砷在0～10 μg/L内线性良好,r=0.999 9,相对标准偏差为2.0%～5.3%,回收率为84%～113%.汞在0～5 μg/L内线性良好,r=0.999 3,相对标准偏差为1.9%～5.7%,回收率为84%～107%.结论该方法灵敏度高,操作简便快捷,结果准确可靠,可同时测定水中砷和汞.
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人工养殖海产品鲜样中铅的荧光分光光度测定法
目的 建立人工养殖海产品中铅的荧光分光光度快速测定方法.方法 采用湿式消解法对中国对虾(养殖)、南美白对虾、梭鱼、矛尾刺虾虎鱼、四角蛤蜊、光滑兰蛤、密鳞牡蛎、中国对虾(野生)样品进行处理,采用浓盐酸作溶剂,荧光分光光度法直接检测铅含量,并与双硫腙光度法的测定结果进行比较.结果 该方法的线性范围为0.10～2.50μg/ml,r=0.989 83,检出限为0.0089μg/ml,回收率为91.88%～104.00%,RSD为1.96%～5.30%.与双硫腙分光光度法测得结果比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 该方法具有操作简便,使用药剂少,灵敏度高,结果准确可靠,常见金属离子干扰小的特点,适用于海产品中铅含量的测定.
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干血片荧光分析法在新生儿苯丙酮尿症筛查中的应用
苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是一种遗传性氨基酸代谢性疾病,是我国新生儿常规筛查项目之一,在我国PKU发病率为1/11188[1].
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荧光定量PCR技术在霍乱弧菌检测中的应用
目的建立霍乱弧菌荧光定量聚合酶链反应检测方法,评价其优越性.方法 根据霍乱弧菌NhaA基因保守序列,设计合成霍乱弧菌FQ-PCR诊断试剂盒,比较该方法与常规检测方法在外环境、海产品及临床病例霍乱弧菌检测上的灵敏度和特异性,结果 在临床患者标本霍乱弧菌的检测上,FQ-PCR与常规方法灵敏度、特异性一致,但在含菌量少、菌株易发生变异(外环境疫水、海产品及霍乱越冬)标本的检测上,FQ-PCR显示出其独特的优越性.结论 FQ-PCR方法用于霍乱弧菌的检测,不仅可避免常规PCR引起的假阳性污染,同时可实现对含菌量少、变异菌株的定量定时检测,对临床检验及卫生检测有较大的指导意义.
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同种异体大鼠移植肺中转录因子T-bet和GATA结合蛋白3的定量表达
背景:急性排斥反应的发病机制主要是T细胞介导的免疫应答,Th1,Th2细胞及其分泌的细胞因子互相调节、交叉作用在其中起重要作用.研究表明,原始Th细胞向Th1或Th2细胞分化受转录因子T-bet和GATA结合蛋白3的表达所调控.目的:在前期实验基础上,应用实时荧光定量聚合酶链反应法测定大鼠移植肺组织中转录因子T-bet和GATA结合蛋白3的mRNA表达,初步分析转录因子T-bet和GATA结合蛋白3在肺移植急性排斥反应中的作用及其意义.设计、时间及地点:单一样奉观察的随机对照动物实验,于2003-08/2008-04在瑞士苏黎世大学医院胸外科实验室和深圳市人民医院临床研究中心完成.材料:纳入LBNF1大鼠10只和Lewis大鼠30只,以建立大鼠左侧原位肺移植模型.方法:将大鼠按随机数字表法分为5组,以肺移植后3.5 d作为观察急性排斥反应的时间点:[1]空白对照组(n=5):取正常Lewis人鼠左肺组织.[2]冷缺血对照组(n=5):冷低钾右旋糖酐液灌注后取Lewis大鼠右侧肺组织.[3]同系移植组(n=5):Lewis→Lewis大鼠肺移植后5 d,取移植左肺组织.[4]同种异体移植3 d组(n=4):LBNF1→Lewis大鼠肺移植后3 d,取移植左肺组织.[5]同种异体移植5 d组(n=6):LBNF1→Lewis人鼠肺移植后5 d,取移植左肺组织.主要观察指标:应用实时荧光聚合酶链反应法,定量检测各组大鼠肺组织巾转录因子T-bet和GATA结合蛋白3的表达.结果:[1]T-bet在同种异体移植5 d组中的表达有所增高,但与其他各组间差异均无显著性意义(P>0.05).[2]GATA结合蛋白3在同种异体移植5 d组中的表达水低于空白对照组、冷缺血对照组及同系移植组(p<0.05).[3]同种异体移植5d组中T-bet/GATA结合蛋白3比值高于其他各组(P<0.05).其他各组间差异均无显著性意义(P>0.05).结论:移植肺组织中GATA结合蛋白3比T-bet的改变更敏感,起主导作用;T-bet/GATA结合蛋白3比值可作为评价肺移植急性排斥反应的客观指标之一.
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低频脉冲超声对肿瘤细胞内化疗药物浓度影响的体外实验研究
目的: 观察低频脉冲式超声波对肿瘤细胞内化疗药物浓度的影响并探讨其作用机制. 方法:将肝癌细胞株 HepG2与临床常用化疗药蒽环类抗生素阿霉素( adriamycin, ADM)共孵育,用不同条件的低频脉冲超声波处理,选不同时间点用流式细胞仪检测细胞内 ADM荧光强度,荧光分光光度计测量细胞膜流动性. 结果: 低频脉冲超声波能显著提高肿瘤细胞 HepG2内 ADM浓度,且这种效应有明显的频率赖性,以 0.8 MHz的频率为理想 , 细胞内 ADM荧光强度大可达 145.12,细胞膜荧光偏振度值由原来的 0.198 5降至 0.162 4,改善细胞膜流动性.另外,细胞内药物浓度与细胞膜流动性呈正相关,提示超声波促进药物进入细胞内的作用是通过提高细胞膜的流动性来实现的. 结论:低频脉冲超声可促进化疗药物进入肿瘤细胞内,这种效应有明显的频率敏感性,其机制与超声提高细胞膜的流动性有关.
