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乙型脑炎病毒非结构4A蛋白编码基因重组子的构建及表达
目的 构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)非结构4A(NS4A)蛋白编码基因重组子并鉴定. 方法 以JEVSA14-14-2株Total RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增JEV NS4A蛋白编码基因,克隆至pMD19-T Simple载体并测序.为便于分析JEV NS4A蛋白编码基因重组子在哺乳动物细胞中的表达,在JEV NS4A蛋白编码基因5'端附加FLAG序列,亚克隆至pcDNA3.1(+)载体中,构建重组子pJNS4A并作酶切及DNA测序分析;采用脂质体法将pJNS4A转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞,采用免疫荧光法检测转染的CHO细胞中JEV NS4A蛋白分布与表达. 结果 重组质粒pJNS4A经BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ酶切释出的插入子在830 bp左右,与JEV NS4A蛋白编码基因和FLAG基因序列之和(834 bp)相一致.JEV NS4A蛋白编码基因重组质粒转染的CHO细胞可见绿色荧光标记,主要分布在胞膜.结论 pJNS4A构建成功,转染的CHO细胞可稳定表达JEV NS4A蛋白.
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乙型肝炎病毒preS/S蛋白对人PCNA基因启动子激活作用的研究
目的研究乙型肝炎病毒preS/S蛋白对人增殖细胞核抗原(PCNA)基因启动子的激活作用.方法利用荧光素酶报告基因,用共转染方法研究该整合片段对人PCNA启动子的作用.用免疫组织化学法确定preS/S蛋白在细胞中的定位.结果在人肝细胞L02中,含有上述HBV整合片段的质粒pKSH7C-HpaⅠ能以剂量依赖方式激活PCNA启动子,使PCNA启动子活性提高0.5倍;免疫组化分析表明,其蛋白定位于细胞质中.结论 preS/S蛋白对PCNA启动子有激活作用,但作用并非直接,可能是通过细胞信号传导途径来影响PCNA活性
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利用昆虫-杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒16型L1蛋白
目的获得人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type 16,HPV16)L1蛋白.方法以pFB1为载体构建HPV 16L1杆状病毒表达质粒,并感染昆虫细胞Sf 9结果收集27℃,培养72 h的感染重组病毒的Sf 9,提取细胞蛋白.经SDS-PAGE蛋白电泳分析,发现有一相对分子质量为56 000的蛋白表达,Western blot证实所表达的蛋白为HPV16 L1.结论昆虫-杆状病毒表达系统可有效地表达HPV 16 L1蛋白.
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人乳头瘤病毒16型结构蛋白在昆虫细胞中的表达
目的在昆虫细胞中表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)结构蛋白,为HPV16型预防性基因工程亚单位疫苗的研究以及诊断试剂的研制奠定基础.方法将目的基因克隆至杆状病毒转移载体,该重组质粒DNA与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf 9,通过同源重组获得重组杆状病毒,用SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot法检测重组子在昆虫细胞中表达的目的蛋白.结果获得了稳定高效表达HPV16结构蛋白的重组杆状病毒,L1和L2蛋白的相对分子质量分别为57 000和97 000,L1蛋白的表达产量约占昆虫细胞总体蛋白的25%～30%.结论人乳头瘤病毒16型结构蛋白可在昆虫细胞内高效表达.
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人乳头瘤病毒2(HPV2)E2蛋白不同功能区突变对转录抑制作用影响的研究
目的 研究HPV2变异株上E2蛋白不同功能区域的点突变对其转录作用的影响.方法 根据HPV2突变株E2上的突变点设计引物,采用延伸法构建不同的E2突变体,并插入到真核表达质粒pcDNA3.1中.表达不同突变体E2的pcDNA3.1-E2与带有HPV原毒株LCR的CAT报道基因载体进行共转染Hela细胞.通过检测CAT的表达量对不同E2突变体的转录抑制作用进行评估.结果 与全长的原毒株E2相比较,去除N端及C端功能区的E2蛋白均降低了E2蛋白对启动子活性的抑制作用.位于E2蛋白转录激活区(nt 3037),铰链区(nt 3387)及DNA结合区(nt 3697)的点突变明显影响了其转录抑制功能.结论 HPV2 E2蛋白的转录调节功能与其转录激活区以及DNA结合区密切相关.HPV2突变株上的不同的E2的单个突变点能够明显降低E2蛋白对启动子活性的抑制作用.
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新型呼肠病毒S1基因真核表达质粒的构建及表达
目的 构建新型呼肠病毒主要抗原蛋白σ1蛋白的真核表达质粒,研究其在真核细胞内的表达.方法 将S1基因克隆入真核表达载体pCAGGS/MCS,构建真核表达质粒pC-S并转染Vero细胞.通过SDS-PAGE和Western-Blot试验,对转染后24,48及72 h的细胞内蛋白表达进行研究.结果 酶切分析表明重组质粒构建成功.SDS-PAGE和Western-Blot的检测结果一致表明,转染后S1基因可在Vero细胞内表达且72 h的细胞内蛋白表达量高.结论 通过构建重组真核表达质粒,可使S1基因在真核细胞内高效表达,为进一步研究新型呼肠病毒与宿主受体的相互作用打下基础.
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HIV-1 Vpr促进Vif和APOBEC3G蛋白表达的研究
目的 观察人获得性免疫缺陷病毒蛋白Vpr对Vif蛋白和APOBEC3G蛋白表达水平的影响.方法 使用电转化法将携带Vif基因的酵母表达载体转化到裂殖酵母中,使用脂质体转染法将表达Vif蛋白、APOBEC3G蛋白的哺乳动物表达载体转染到可诱导稳定表达Vpr蛋白的哺乳动物HEK293细胞中;使用Western Blot方法检测目标蛋白表达水平的变化.结果 在裂殖酵母和哺乳动物细胞中,Vpr蛋白的表达能够提高细胞内的Vif蛋白的表达水平,在哺乳动物细胞中,Vpr蛋白对APOBEC3G蛋白的表达亦有促进作用,Vpr蛋白引起的Vif蛋白量的提高并没有导致APOBEC3G蛋白的减少.结论 Vpr蛋白具有调节细胞内蛋白表达的功能.
关键词： 获得性免疫缺陷综合征 病毒蛋白质类 裂殖酵母菌属 -
H5N1亚型流感病毒M2与NA基因真核表达载体的构建与鉴定
目的 构建表达H5N1亚型流感病毒M2和NA基因的多种真核表达载体.方法 以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)作为研究对象,PCR扩增全长M2与NA基因.将M2基因克隆入真核表达载体pStar的IRES上游或下游的MCS,构建重组pStar-M2/和pStar-/M2.将NA基因克隆人pStar载体IRES上游或下游的MCS,构建重组pStar-NA/和pStar-/NA.将M2和NA基因先后克隆到pStar载体IRES序列的上游和下游MCS,分别构建双基因共表达重组pStar-M2/NA和pStar-NA/M2.将重组质粒转染293细胞,使用IFA方法 检测各重组质粒相应外源基因的表达.结果 通过酶切鉴定,各重组质粒构建正确.将其转染293细胞后,使用IFA方法 检测到了各重组质粒中相应外源基因的表达.结论 构建了多种表达H5NI亚型流感病毒M2和(或)NA基因的真核表达载体,为研究开发流感DNA疫苗奠定了基础.
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NDV LaSota株P、NP蛋白基因表达载体的构建及鉴定
目的 构建新城疫病毒LaSota株NP、P基因的真核表达载体,为研究NP、P蛋白机理及反向遗传操作系统奠定基础.方法 利用RT-PCR法扩增出新城疫病毒LaSota株的NP、P基因,并将其克隆到pGEM-T easy载体中,并再次亚克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上,得到重组质粒pcDNA3.1(+)-NP、pcDNA3.1(+)-P,瞬时转染到293、BHK-21 细胞中,免疫酶法及Western Blot法检测表达情况.结果 经免疫酶法及Western Blot法分别检测到了P、NP蛋白在两种细胞的表达.结论 构建的两个重组质粒pcDNA3.1(+)-NP、pcDNA3.1(+)-P 在293、BHK-21两种细胞中均可稳定表达,为即将进行的NDV反向遗传操作系统奠定基础.
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E抗原阴性慢性乙型肝炎病毒大蛋白用于观测抗病毒治疗效果临床意义
本资料主要检测乙肝患者血清中乙型肝炎病毒大蛋白(LHBs)、HBV DNA、HBV-M,LHBs与HBV DNA联合检测评价抗病毒治疗效果的临床意义.1 资料与方法1.1 一般资料 选择2007-04/2008-10住院或门诊HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者351例,其中男207例,女144例,年龄19～64岁,平均年龄42.3岁.其中经过抗病毒治疗大于6个月的患者95例;未经抗病毒治疗患者256例.应用阿德福韦酯(批号H20050803,天津药物研究院药业有限责任公司)10 mg口服,1次/d.
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利用戊型肝炎病毒开放读码框架2截短多肽降低抗戊型肝炎病毒IgM检测中的假阳性
目的 研究用戊型肝炎病毒4型(HEV4-)开放读码框架(ORF)2主要免疫表位截短多肽排除抗-HEV IgM检测中发生假阳性的可行性.方法 用重组HEV-4 ORF2蛋白主要抗原决定簇多肽(459～607位氨基酸)及其截短多肽(472～607位氨基酸)为抗原分别包被ELISA板,用间接ELISA法分别检测35份HEV RNA阳性患者血清、69份健康人血清和117份可疑阳性血清标本的抗-HEV ISM,并用免疫印迹法(Western blot,WB)确认,逆转录(RT)-PCR检测HEV RNA加以比较.结果 WB检测结果显示,戊型病毒性肝炎患者血清中抗-HEV ISM仅与459～607多肽二聚体反应,而不与其单体及472～607多肽反应.间接ELISA法检测35份HEV RNA阳性患者血清抗-HEV IgM均能与459～607多肽反应,而不与472～607多肽反应;69名健康人血清与2种多肽都不反应.117份可疑阳性血清中,5份能同时与2种多肽反应,但450 nm吸光度(A450)值之差小于0.5.WB检测这5份血清抗-HEV IgM均阴性;RT-PCR检测HEV RNA为阴性,说明这5份血清为非特异性吸附引起的假阳性.结论 ORF2 459～607多肽可有效检测抗-HEV ISM,根据血清与2种多肽反应的A450差异,能有效排除因非特异性吸附导致的抗-HEV IgM假阳性.
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乙型肝炎病毒x蛋白对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响
目的探讨乙型肝炎病毒x蛋白(hepatitis B virus x protein, HBx)在体内外对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响. 方法将携带HBx基因的表达质粒pHA-HBx转染HepG2细胞,通过检测细胞生长曲线、倍增时间和3H-TdR掺入率观察HBx对细胞增殖活性的影响;将整合HBx基因的HepG2细胞接种裸鼠,建立表达HBx的人肝癌裸鼠模型,用阿霉素进行裸鼠腹腔化学药物治疗,观察肝癌组织的生长状况;用TUNEL方法检测切除的裸鼠癌标本中凋亡细胞的比例. 结果转染HBx基因的HepG2细胞倍增时间为28.5h,对照组为32.5h;3H-TdR掺入率:转染HBx基因组为(1021±78)cpm,对照组为(859±69)cpm,转染组细胞明显高于对照组细胞(t=2.54, P<0.01);转染HBx基因的细胞在裸鼠体内形成的癌重量为(3.10±0.39)g,对照组癌重量为(2.61±0.28)g,两组之间差异有显著意义(t=2.03, P<0.05);裸鼠腹腔化学药物治疗后,转染组的癌细胞凋亡为3.5±0.75,对照组为22.5±6.5,转染HBx基因的细胞凋亡明显减少(χ2=6.69, P<0.01). 结论 HBx可以提高HepG2细胞的增殖活性,促进裸鼠体内肝癌生长,对阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡具有抑制作用.
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北京地区人群中人偏肺病毒血清抗体水平的初步调查
目的通过对人类偏肺病毒(hMPV)特异性IgG抗体检测,初步了解北京地区人群中该病毒感染的状况.方法以大肠杆菌表达的hMPV 核蛋白(N蛋白)为抗原,用Western-blot检测随机选取的116例血清标本中hMPV N蛋白特异性IgG抗体,以确定表达的hMPV N蛋白的抗原特异性. 随后对1996年4月至1997年3月自首都儿科研究所附属儿童医院和北京宣武医院采集的门诊非呼吸道感染患者及正常儿童的体检血清710例进行hMPV N蛋白特异性IgG抗体检测.结果hMPV N蛋白的抗原特异性试验证明表达的hMPV的N蛋白特异性好.本组710份血清中,抗hMPV N蛋白IgG抗体总阳性率为17.2%(122/710).其中<1个月的婴儿抗体阳性率为13.2%,1个月～的婴儿中抗体阳性率下降至6.1%,2个月～的婴儿中抗体阳性率降至低(3.1%),6个月～的婴儿中抗体阳性率上升至13.9%,在随后的几个年龄段内抗体阳性率维持在13.0%左右,30岁以后的人群中抗体阳性率有所升高,30岁～人群中达28.1%,40岁～人群中达32.3%,≥50岁的人群中达38.5%.结论研究中所应用的hMPV N蛋白的抗原特异性好;抗体的检测结果提示在北京地区的人群中hMPV的感染并不少见,血清抗体阳性率低的年龄组与文献报道感染发生率高的年龄组相符.
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顺铂诱导宫颈癌SiHa细胞周期阻滞及凋亡的研究
目的:探讨顺铂在体外对宫颈癌SiHa细胞周期和凋亡的影响及其作用机制.方法:采用MTT法测定顺铂对SiHa细胞增殖的影响;DNAladder和Hoechst33258检测药物作用前后的细胞凋亡情况;流式细胞仪检测药物作用前后的周期阻滞和凋亡;Westem blot检测E6、p53和p21的表达.结果:顺铂抑制SiHa细胞生长呈时效和量效关系,10 mol/L顺铂作用SiHa细胞12、24、36和48 h,亚G1峰分别为(3.07士0.15)%、(5.18±0.28)%、(17.73±1.20)%和(32.55±2.74)%,与对照组比较差异均有统计学意义,t值分别为32.80、31.46、29.73和25.99,P值均为0.000;顺铂能使SiHa细胞发生G2～M期阻滞,24 h达到高(66.43±4.62)%,凋亡开始;Hoechst33258实验组可见凋亡细胞;琼脂糖凝胶电泳出现DNA梯形条带;Westernblot提示,顺铂作用SiHa细胞后HPV E6的蛋白水平表达逐渐降低,p53和p21蛋白水平表达逐步升高.结论:顺铂随着药物浓度和作用时间的增加对SiHa细胞的体外抑制效应增加,顺铂通过引起SiHa细胞G2～M周期阻滞及抑制HPV E6蛋白的表达,恢复p53功能,启动凋亡,起到杀伤肿瘤作用.
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非小细胞肺癌组织Bmi-1和VEGF表达及其临床意义的研究
目的:探讨鼠类淋巴瘤滤过性病毒致癌基因(Bmi-1)和血管内皮生长因子(VEGF)在非小细胞癌(NSCLC)组织中的表达及其与临床预后的相关性.方法:应用免疫组化SABC法检测180例NSCLC组织中Bmi-1与VEGF表达水平及微血管密度(MVD).结果:NSCLC组织中Bmi-1阴性表达为10.6％(19/180),阳性表达率为30.6％(55/180),强阳性表达率为58.9％(106/180)；Bmi-1与癌旁组织比较,差异有统计学意义,P=0.026.Bmi-1的表达与VEGF表达密切相关,P=0.001；并且Bmi-1 高表达也同时伴随着MVD计数增高,P=0.005.在VEGF强阳性/Bmi-1阳性组的23例患者中有14例(60.9％)MVD计数增高,差异有统计学意义,P=0.001.在VEGF强阳性/Bmi-1强阳性组的41例患者中有34例(82.9％)MVD计数增高,差异有统计学意义,P=0.001.多因素统计分析显示,Bmi-1阳性或强阳性合并VEGF强阳性表达、淋巴结转移和MVD增高是NSCLC预后的独立危险因素.结论:Bmi-1在NSCLC的肿瘤血管生成和进展中起重要作用,Bmi-1和VEGF同时高表达是NSCLC不良预后的因素.
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HBx蛋白和p53蛋白对细胞凋亡的调节及其在肝细胞癌发生中的作用
目的:研究HBx蛋白对细胞凋亡的调节及其在肝细胞癌发生中的作用.方法:采用SP免疫组化方法和原位脱氧核糖核酸末端转移酶标记技术分别检测HCC组织中HBx和p53蛋白表达及细胞凋亡.结果:HCC和癌旁组织中的HBx蛋白的阳性率分别为52.5%(21/40)和67.5%(27/40),在HCC中阳性信号多为呈核型,癌旁组织中以核浆型为主,阳性细胞多呈区域性或簇状分布;HCC中p53和HBx蛋白的表达具有较高的一致性(P<0.01);p53和HBx表达强度均与凋亡细胞相关,其表达增强则凋亡细胞密度逐渐降低(P<0.01).结论:提示HBx蛋白可能通过抑制p53的功能阻止细胞凋亡和促进细胞增殖,导致细胞生长失控和表现更高的恶性表型.
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病毒性脑炎患者血液和脑脊液博尔纳病病毒p24的检测
目的探讨博尔纳病病毒(BDV)与病毒性脑炎(VE)的关系.方法采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)结合荧光定量(FQ)PCR检测了52例VE患者和32例外科手术患者外周血液(PBMC)和脑脊液有核细胞(CSFMC)中的BDV p24基因片段, 对阳性产物进行了基因序列测定、同源性和氨基酸顺序分析. 结果 VE患者PBMC和CSFMC中BDV p24基因片段阳性率(分别为9.6%和11.5%)明显高于对照组(0,P<0.05);PBMC和CSFMC中BDV p24基因片段拷贝数的对数值呈显著正相关(r=0.653,P＜0.05);CSFMC所含目的基因片段阳性产物测序后,与BDV标准病毒株V核苷酸序列比较同源性为96.5%,在3个位点出现突变(nt1649T→C,nt1670C→T,nt1673C→T),突变率为3.5%.从系统发生树图形可以看出,该目的基因片段与澳大利亚马脑组织分离的S88和德国绵羊血液分离的H544病毒株亲缘关系近.结论宁夏及其周边地区部分VE患者中可能存在BDV感染.
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病毒性脑炎患者Borna病病毒P24基因片段的检测
目的探讨Borna病病毒(BDV)感染与人类病毒性脑炎的关系.方法采用荧光定量套式逆转录酶聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)检测了59例临床诊断的原因未明的病毒性脑炎及112名健康人外周血单个核细胞(PBMC)中BDV P24基因片段.结果59例原因未明的病毒性脑炎患者中有3例PBMC中检出BDV P24基因片段,而112名健康对照均未检出.病毒性脑炎患者BDV阳性率(5.08%)高于健康对照,差异有统计学意义(P＜0.05),且BDV P24基因片段检测阳性病例的脑脊液中其他常见致脑炎病毒(单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、柯萨奇病毒和巨细胞病毒)检查均为阴性.结论中国的部分病毒性脑炎患者中存在BDV感染,BDV感染与病毒性脑炎的发病可能有关.
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以精神行为异常起病的脑炎患者与博尔纳病病毒感染的关系
目的 探讨以精神行为异常为主要起病方式的脑炎患者与博尔纳病病毒(BDV)感染的相关性,分析感染BDV的脑炎患者临床特征.方法 采用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应方法检测36例有精神行为异常的脑炎患者(患者组)外周血和脑脊液有核细胞中BDVp24和BDVp40基因片段.以B-肌动蛋白作为内参照,同时检测34名健康体检者的外周血和30例实行腰麻患者的脑脊液(对照组)有核细胞中BDVp24和BDVp40基因片段.对BDVp24和BDVp40基因片段均为阳性的标本进行基因测序分析,外周血进行BDV抗体滴度测定,对患者的精神症状采用阳性与阴性症状量表评分,并总结阳性患者的临床特征.结果 4例以精神行为异常为主要起病方式的脑炎患者外周血和脑脊液标本BDVp24、BDVp40基因片段检测均为阳性,阳性率为11.1％ (4/36),有1例脑脊液BDVp24阳性而外周血单个核细胞中BDVp40基因片段检测阴性,拷贝数均＞102 kb/μl.对照组检测BDVp24、BDVp40基因片段均为阴性(0/34、0/30),两组阳性率比较差异有统计学意义(P=0.015).对BDVp24和BDVp40基因片段均为阳性的标本进行测序后,发现与马源的BDV病毒株亲缘关系近.阳性标本的精神症状主要以幻觉、妄想等阳性症状为主,阳性与阴性症状量表评分均在40分以上.结论 以精神行为异常起病的脑炎患者与BDV感染有一定的相关性.BDV感染患者主要以阳性精神症状为主.
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三种病毒载体经蜗窗膜导入大鼠耳蜗的靶向分布比较
目的 比较3种病毒载体经蜗窗膜注人大鼠耳蜗鼓阶介导报告基因在内耳的转染分布,甄选螺旋神经节细胞及其神经纤维基因靶向转移载体.方法 分别将带有绿色荧光蛋白基因的慢病毒、5型-腺病毒、2型-腺相关病毒载体经大鼠耳蜗蜗窗膜缓慢注人鼓阶外淋巴,荧光显微镜观察病毒载体导入后3、7、14天绿色荧光蛋白基因在内耳表达部位及荧光强度.结果 经蜗窗膜注入3种病毒载体能有效转染内耳多种类型细胞,相对其他两种病毒载体,5型-腺病毒载体高效转染螺旋神经节及其神经纤维,持续稳定表达2周以上.结论 不同病毒载体经蜗窗膜导入后,在耳蜗内的表达分布存在明显差异,5型-腺病毒高效转染耳蜗神经,可作为未来听神经病变分子治疗的载体工具选用.
