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寨卡病毒NS4A蛋白影响小鼠大脑皮质神经元的迁移
目的 在体研究寨卡病毒(Zika virus) NS3和NS4A蛋白对大脑皮质神经元迁移的影响.方法 通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)及反转录PCR测定Zika病毒SZ01株基因组的开放阅读框,确定NS3和NS4A蛋白编码序列,构建融合Flag标签的pCIG蛋白表达载体.通过子宫内电转技术在E13.5 d小鼠的大脑皮质的神经前体细胞中表达病毒蛋白.免疫组化检测Flag标签、TBR1与eGFP,观察表达NS3和NS4A蛋白的细胞在E18.5 d大脑皮质中的分布,评估Zika病毒蛋白对大脑皮质神经元迁移的影响.结果 1)NS4A的氨基酸序列与NCBI数据库一致,NS3存在1处氨基酸位点突变.2)Flag标签荧光信号与eGFP荧光共定位,提示eGFP可以指示病毒蛋白在皮质中的表达.3)TBR1荧光显示在体表达NS4A后,神经元的分布与pCIG对照组及表达NS3相比有显著差异(P＜0.001).结论 在体表达Zika病毒的NS4A蛋白可能影响神经元迁移.
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乙型脑炎病毒非结构4A蛋白编码基因重组子的构建及表达
目的 构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)非结构4A(NS4A)蛋白编码基因重组子并鉴定. 方法 以JEVSA14-14-2株Total RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增JEV NS4A蛋白编码基因,克隆至pMD19-T Simple载体并测序.为便于分析JEV NS4A蛋白编码基因重组子在哺乳动物细胞中的表达,在JEV NS4A蛋白编码基因5'端附加FLAG序列,亚克隆至pcDNA3.1(+)载体中,构建重组子pJNS4A并作酶切及DNA测序分析;采用脂质体法将pJNS4A转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞,采用免疫荧光法检测转染的CHO细胞中JEV NS4A蛋白分布与表达. 结果 重组质粒pJNS4A经BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ酶切释出的插入子在830 bp左右,与JEV NS4A蛋白编码基因和FLAG基因序列之和(834 bp)相一致.JEV NS4A蛋白编码基因重组质粒转染的CHO细胞可见绿色荧光标记,主要分布在胞膜.结论 pJNS4A构建成功,转染的CHO细胞可稳定表达JEV NS4A蛋白.
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丙型肝炎病毒 NS4A蛋白在胰腺细胞 cDNA文库中的结合蛋白基因的筛选
目的:从人胰腺细胞cDNA文库中筛选出与丙型肝炎病毒(HCV)NS4A蛋白存在相关作用并且参与糖、脂类代谢过程的结合蛋白,为研究HCV影响糖、脂类代谢的分子生物学机制提供实验依据.方法:构建pGBKT7-NS4A作为诱饵质粒,转化酵母菌株AH109,用SD/-Trp筛选阳性菌落.配合两种重组酵母菌株AH109与Y187(人胰腺细胞cDNA文库质粒转化),用四缺培养基及X-α-gal筛选蓝色酵母菌落,提取相应质粒,电转化感受态菌DH5α后再提取质粒,测序仪测序,结果使用PUMED进行序列比对.结果:用pGBKT7-HCV NS4A重组质粒作为诱饵,成功从人胰腺cDNA文库中筛选出5种与HCV NS4A蛋白相结合的蛋白基因,包括CDK5R1、弹性蛋白酶3A、胰脂肪酶、KRAS和胆盐刺激酯酶.结论:HCV NS4A蛋白与胰腺文库中的上述5种代谢相关蛋白存在相互作用,从而影响糖代谢过程.
关键词： 人胰腺细胞cDNA文库 肝炎病毒 丙型 NS4A蛋白
