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寨卡病毒NS4A蛋白影响小鼠大脑皮质神经元的迁移
目的 在体研究寨卡病毒(Zika virus) NS3和NS4A蛋白对大脑皮质神经元迁移的影响.方法 通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)及反转录PCR测定Zika病毒SZ01株基因组的开放阅读框,确定NS3和NS4A蛋白编码序列,构建融合Flag标签的pCIG蛋白表达载体.通过子宫内电转技术在E13.5 d小鼠的大脑皮质的神经前体细胞中表达病毒蛋白.免疫组化检测Flag标签、TBR1与eGFP,观察表达NS3和NS4A蛋白的细胞在E18.5 d大脑皮质中的分布,评估Zika病毒蛋白对大脑皮质神经元迁移的影响.结果 1)NS4A的氨基酸序列与NCBI数据库一致,NS3存在1处氨基酸位点突变.2)Flag标签荧光信号与eGFP荧光共定位,提示eGFP可以指示病毒蛋白在皮质中的表达.3)TBR1荧光显示在体表达NS4A后,神经元的分布与pCIG对照组及表达NS3相比有显著差异(P＜0.001).结论 在体表达Zika病毒的NS4A蛋白可能影响神经元迁移.
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小鼠胚胎发育过程中N-Cadherin异常表达对大脑皮层神经元迁移的影响
目的:探究N-Cadhetin异常表达对小鼠大脑皮层发育过程中神经元迁移的影响.方法:通过小鼠活体子宫电转基因技术和RNA干扰技术相结合,在小鼠胚胎大脑皮层发育过程中实现对N-Cadherin的超表达和抑制表达,荧光免疫组化检测超表达结果,用GFP示踪N-Cadherin超表达和抑制表达后神经元在大脑皮层发育过程中的迁移特征.结果:与对照组相比,N-Cadherin超表达后有更多的GFP阳性神经元迁移到皮层的Ⅱ-Ⅳ层；N-Cadherin被抑制后大量GFP阳性神经元停滞在SVZ区.结论:N-Cadherin在小鼠大脑皮层发育过程中对神经元的迁移具有影响作用.
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小鼠子宫内电转基因方法的建立
目的:建立小鼠子宫内电转基因技术,比较分析转染绿色荧光蛋白(GFP)后对胚胎发育及相关蛋白表达的影响.方法:将怀孕15d的小鼠,水合氯醛麻醉后,取出两侧子宫,用毛细管注射针将2μg/μl的pCAGGS-GFP质粒0.5～1 μl准确注射到胎鼠侧脑室,在电压40 V、每次脉冲60 ms,间隔940 ms,电脉冲6次的条件下进行定时定位活体电转基因,电转后24 h取材,甲醛固定冷冻冠状切片,DAPI染细胞核观察组织形态结构变化,荧光免疫组织化学检测α-SMA的表达差异.结果:妊娠15d孕鼠转染24 h后小鼠成活率80％(8/10),胚胎成活率为54.2％(13/24),存活胚胎GFP阳性表达率为61.5％(8/13),GFP阳性表达胚胎脑组织切片,基因转染区域和正常组织区组织形态结构和α-SMA表达不存在差别.结论:成功建立了小鼠子宫内电转基因的方法.
