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实时荧光定量PCR法检测新城疫病毒的方法建立
为建立新城疫病毒的荧光定量PCR快速检测方法,根据新城疫病毒的基因序列设计引物与探针,通过Taq Man一步法qRT-PCR检测方法快速检测样品.结果表明,该方法能准确、快速地检测新城疫病毒,且特异性、灵敏度、稳定性较强,能够满足实际工作中的检测要求.
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基因扩增产物微孔杂交法检测新城疫致病毒株
[目的]建立一种快速、简便、敏感、实用的方法以鉴别新城疫病毒(NDV)强弱毒株.[方法]依据NDV强弱毒株F0蛋白在裂解位点处的核酸序列有差异,设计一种针对强毒株的探针,利用基因扩增物微孔杂交法,检测标本中NDV致病毒株.[结果]缩短杂交时间,加快反应速度,能从强、中、弱毒株中扩增出371bp的核酸产物.利用酶显色法杂交结果,比电泳法观察PCR结果高4倍.[结论]本方法经优化PCR参数后,可作为新城疫的诊断方法,又可作为出入境检疫的常规方法.
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以膜融合脂质体为载体治疗肿瘤的研究进展
本文介绍了膜融合脂质体的膜融合机制、制备及其在近几年来肿瘤治疗方面的研究进展,研究显示膜融合脂质体具有制备方法简单,不良反应小,有融合特性等特点,作为一种新型的载体系统,在肿瘤治疗方面有着广阔的发展前景.
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抗体选择压作用下新城疫病毒HN和F基因的演化及其抗原性变异的比较分析
TZ060107株新城疫病毒(NDV)在含有对它抗体的鸡胚成纤维细胞(CEF)培养上分3个独立系列连传50代,每10代扩增其HN和F基因并测序.选择变异大的系列A1-50病毒,再在含有抗A1-50抗体的CEF培养上分3个独立系列连续传50代,同时设3个不带抗体的独立传代系列作为对照.对第60、70、80、90、100代病毒的HN和F基因序列比较结果显示,有抗体组HN基因的非同义突变(NS)对同义突变(S)比值NS/S为5.25,明显高于无抗体组NS/S的2.375.前50代在抗体选择压作用下已发生的稳定NS突变在含有抗A1-50抗体的细胞培养中传代仍能稳定保持,且又出现了一个新的稳定的NS突变位点.在有抗体组经传50代后F基因发生的稳定非同义突变,在抗A1-50血清作用下再连传50代后也仍然保持,且又出现3个新的稳定的NS突变.不同传代病毒与原始病毒间的血清交叉血球凝聚抑制试验结果表明,随着在含有抗NDV血清的细胞培养上传代代数的增加,病毒与原始病毒间在抗原性的差异越来越大.
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新城疫病毒F蛋白细胞融合活性位点中保守氨基酸基因突变分析
为了确定新城疫病毒融合蛋白(F)分子上活性位点中保守氨基酸在F蛋白的细胞融合作用,弄清F细胞融合的分子机理,采用基因定点突变法,创造一个酶切位点,用酶切反应初步筛选突变株,然后用DNA序列分析进一步确定,并于真核细胞内进行表达,Giemsa染色定性和指示基因法定量检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测表达效率情况.结果表明, NDV F 第117位苯丙氨酸(F)突变成亮氨酸(L)时对细胞融合作用没有显著影响.R112和K115同为保守序列,分别突变为G时,细胞融合活性只有原来的44%,下降了56%.细胞表面表达效率没有明显的改变.N147突变为K时,细胞融合活性明显下降,只有原来的15%,而细胞表面表达效率没有明显的改变.L154为保守序列,突变为K时,细胞融合活性消失,说明L154是一个非常关键的氨基酸,对维持F蛋白的细胞融合活性非常重要.细胞表面表达效率也有所下降(为原来的94%).D462属于高度保守氨基酸,当突变为N时,细胞融合活性消失,但经细胞表面表达效率分析证明,此突变蛋白未表达于细胞表面,证明在细胞浆转运至细胞表面的过程中发生了问题.当突变为R和E时,细胞融合活性未发生改变,但细胞表面表达效率有所下降,分别为野毒株的63%和44%.说明 NDV F分子上与 HN相互作用的特异性区域中的某些保守氨基酸在细胞融合中发挥着重要作用,对F蛋白的折叠、加工、转运等,发挥着不同作用,从而影响F蛋白的细胞融合作用和/或在细胞表面的表达量.
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新城疫病毒HN基因的遗传变异与HI相关性的研究
选取国内1999～2004年分离的新城疫野毒10株,经CEF蚀斑纯化和SPF鸡胚增殖,对其血凝素-神经氨酸酶(HN)基因分别进行克隆和测序,结合在GenBank中发表的LaSota、F48E9和Clone30等参考序列,对其氨基酸序列进行遗传变异分析,绘制系统发育树.利用SPF鸡在隔离器中分别制备上述NDV毒株的单因子阳性血清,进行血凝抑制(HI)交叉试验,计算NDV不同株之间的HI相关系数(r).利用统计学软件SPSS8.0对NDV不同株之间的HN氨基酸同源率和HI相关系数(r)进行相关比较.结果表明:NDV野毒间氨基酸高度同源,同源性为96.5%～99.8%,而与LaSota、F48E9和Clone30同源率仅为87.4%～89.9%;所有野毒均缺乏1个潜在的糖基化位点;HN基因的氨基酸同源性与HI相关系数显著相关(P<0.01,r=0.55).
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新城疫病毒分离株HN和P基因分子进化及其相关研究
为探讨新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)和磷蛋白(P)基因遗传特性以及相互关系,将1997～2005年间国内分离到12株NDV毒株,分别进行HN和P基因克隆测序,结合15个已发表的国内外不同时期的NDV毒株HN和P基因,计算所有毒株HN和P基因的不同核苷酸和氨基酸片段进化距离,利用统计软件进行了不同片段间进化距离的方差分析,HN或P基因核苷酸进化距离与毒株分离时间、HN或P基因片段与其全长间以及HN和P基因全长间的相关分析.统计分析显示:NDV HN或P基因不同核苷酸和氨基酸序列片段变异程度不一样;不同毒株间HN或P基因片段与其全长间以及HN和P基因全长间无论是核苷酸还是氨基酸遗传变异高度相关.以上说明,NDV HN和P基因虽以不同的方式进化,但是HN和P基因遗传变异的趋势是相同的.HN和P基因的变异与分离时间有一定的联系.
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慢病毒介导的靶向NDV P基因shRNA对NDV复制的抑制作用
小干扰RNA(siRNA)诱导的RNA降解可以特异性地抑制病毒感染,它作为一种有效的抗病毒治疗方法正被广泛研究.为了探讨慢病毒介导的shRNA对NDV复制的抑制效果,从而为新城疫病毒的抗病毒研究奠定基础,本研究以新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)P基因为靶基因,构建了靶向NDV P基因的shRNA重组慢病毒表达载体RNAi-341和RNAi-671.将其与辅助细胞共转染293T细胞,获得包装好的重组慢病毒;在鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)和SPF鸡胚上进行了干扰实验,并通过荧光定量PCR和病毒滴度测定检测shRNA对NDV的抑制效果.结果发现,RNAi-341和RNAi-671均能抑制FLAG-P蛋白在293T细胞中的瞬时表达.在CEF细胞感染后16h后,NDV的病毒滴度分别降低了66.6倍和30.6倍;在鸡胚感染48h后,RNAi-341和RNAi-671组NDV病毒的增殖量分别减少99％和98％.RNAi-341与RNAi-671不仅能抑制P基因的转录,还能显著降低NP、M、F、HN和L基因的转录水平.与RNAi-671相比,RNAi-341的抑制效果更好.研究结果表明,慢病毒介导的靶向P基因的shRNA具有抗病毒作用,能够抑制NDV在CEF和鸡胚中的复制,从而为临床防治NDV提供一个新方法.
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鸡源和鹅源新城疫病毒在宿主细胞上的蚀斑形成特性及形态发生学比较
通过蚀斑形成试验比较鸡源(F48E9株)和鹅源(NA-1株)新城疫病毒在不同细胞的蚀斑形成能力,结果显示F48E9、NA-1两种病毒在Vero细胞、鸡胚成纤维细胞(CEF)和鹅胚成纤维细胞(GEF)上蚀斑形成能力存在明显的差异,在GEF上NA-1株的蚀斑形成能力强于F48E9株,而在CEF上弱于F48E9株,在Vero细胞上NA-1株的蚀斑形成能力稍强于F48E9株,表明病毒蚀斑形成特性与宿主种属特性一致.通过电镜观察两株病毒以相同感染量感染Vero细胞后的病毒形态发生过程.NA-1株和F48E9株病毒在Veto细胞中不同时段的形态发生的进程上存在区别,无论从出芽时间还是出芽后病毒囊膜的完整性上,NA-1株均优于F48E9株,提示NA-1株病毒对宿主环境的适应力较强.
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四株不同宿主来源的Class I基因3型新城疫病毒全基因组序列测定及比较分析
为了解析基因型相同但宿主来源不同的新城疫病毒的全基因组差异.本文采用RT-PCR方法分别获得4株(JS/3/09/Ch,ZJ/3/10/Ch,AH/2/10/Du,JS/9/08/Go)Class I基因3型病毒的全基因组核苷酸序列,并与GenBank中已公布的Class I基因3型病毒全基因组序列进行比对分析.本实验4株病毒的基因组长度均为15 198bp,在基因组1 607～1 608位有6碱基的缺失,在2 381～2 382位有12碱基的插入,裂解位点为11 2EQ/RQE/GRL117是标准弱毒特征.5株ClassI基因3型病毒之间全基因组同源性超过93％；而与Class Ⅱ弱毒株同源性低只有72.2％;比较6个结构蛋白基因的同源性,NP基因的同源性高(98.3％～96.4％),而P基因低(96.1％～91.9％).结果表明不同宿主来源的Class I基因3型新城疫病毒在遗传信息方面差异不大,但NP/F/L基因的变异幅度较P/M/HN基因明显.
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新城疫分离毒HN基因的分子特性和片段同源相关性
选取国内1997～2005年分离的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)24株,经蚀斑纯化克隆其血凝素-神经氨酸酶(HN)基因,与在GenBank发表的36株国内外不同时期的NDV毒株,进行氨基酸遗传变异分析,并利用SPSS8.0软件对其不同片段的氨基酸进行同源相关比较.结果显示:国内所有NDV分离毒株氨基酸高度同源,同源性为94.4%～99.4%;与LaSota、Clone30疫苗株等的氨基酸同源性为86.9%～89%;与强毒株F48E9的氨基酸同源性为87.9%～89.9%;与国外NDV的氨基酸同源性为87.2%～96.2%.系统发育分析表明:国内NDV分离毒HN遗传距离较近,而与LaSota、Clone30和F48E9遗传距离较远.国内NDV分离毒均缺乏538～540位糖基化位点.不同片段与全长的氨基酸同源性高度相关,且与前80个氨基酸相关密切.
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新城疫病毒分离株的生物学特性鉴定及F蛋白基因序列分析
通过部分生物学特性鉴定、RT-PCR及F基因的序列测定与遗传进化分析,对2005～2006年从我国江苏省和广西省部分地区的发病鸡群和鹅群中分离到的20株新城疫病毒(NDV)进行了研究.各分离株经典毒力测定结果显示:MDT在45.3h～58.2h之间,ICPI在1.61～2.00之间,均为新城疫病毒强毒株特征.血凝解脱及血凝素热稳定性试验显示:各分离株的血凝解脱时间短,血凝素热稳定性较差,符合NDV强毒株的特征.F基因的序列测定表明,分离株之间的核苷酸序列具有79.7%～100%的同源性,与疫苗株LaSota的同源性为78.1%～83.4%,与国内标准强毒株F48E8同源性为80.2%～90.1%.推导其氨基酸序列分析表明,各分离株的F蛋白的裂解位点氨基酸组成为112R-R-Q-R/K-R-F117,具有NDV强毒株特征,与毒力测定结果相符.根据序列所绘制系统进化发生树,表明20株NDV分离株中有18株为基因Ⅶd型,2株为基因Ⅲ型.
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三株新城疫病毒强毒株的生物学特性及全基因组序列分析
2009～2011年从北方发病鸡群和鸭群中分离出3株新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV).通过致病性指数测定及交叉血凝抑制试验初步分析了3个毒株的毒力和相互之间的同源性.选取鸡源分离株SDLY01与新城疫疫苗株( LaSota)进行了交叉保护试验,选取鸭源毒株SD03对樱桃谷鸭进行攻毒实验,同时设计引物对3个毒株进行了全基因组测序,并与36株NDV参考株进行了分子进化分析.结果表明3个分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列均为112R-R-Q-K-R-F117符合强毒株的序列特征,并与致病性指数测定结果相符.交叉血凝抑制试验发现3个分离株与疫苗株LaSota的抗原同源性较低为82.5％～89.4％,两个鸡源分离株间的抗原同源性为90％,而鸭源毒株SD03与鸡源毒株SDSG01同源性为100％.交叉保护试验和攻毒实验结果显示传统的LaSota疫苗能对SDLY01流行株提供100％免疫保护,但第5天仍检测到排毒;鸭源毒株SD03对樱桃谷鸭不致病,但能检出排毒,排毒期长为5d.全基因组测序与分析表明3个毒株基因组长度均为15 192bp,属于基因Ⅶd型毒株,与同期流行的鹅源及鸭源NDV毒株之间全基因组核苷酸序列具有高度的同源性,揭示鸭源、鹅源NDV与鸡源NDV在遗传学和流行病学上密切相关.
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副粘病毒包膜糖蛋白分子生物学研究进展
副粘病毒是一类重要的人和动物致病病毒.其中包括副流感病毒(Parainfluenza virus,PIV)、流行性腮腺炎病毒(Mumps virus,MuV)和新城疫病毒(Newcatle disease virus,NDV).这些病毒在中性pH条件下,可以通过膜融合而感染宿主细胞.
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鹅源新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因的序列分析
新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)是副粘病毒科腮腺炎病毒属的成员,基因组全长15 186个核苷酸(nt),编码6种结构蛋白,即基质蛋白(M)、核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)及融合蛋白(F),其中HN和F位于病毒囊膜表面,前者负责识别细胞受体并介导病毒对细胞的吸附,后者则参与病毒的穿透、细胞融合和溶血等过程.NDV可以感染多种禽类,尤其是感染鸡以后可致严重发病,造成重大的经济损失;现有的文献记载一般认为水禽如鸭、鹅对NDV具有较强的抵抗力[1],感染后症状轻微或不表现临诊症状[2].然而1997年以来,我国华东地区部分省市陆续爆发一种被称为"鹅的禽副粘病毒感染"或"鹅副粘病毒病"的传染病[3,4],对养鹅业构成较大威胁.在本病的研究过程中,从江苏、浙江、广东等地的患病鹅群分离到数株NDV,并证实NDV是本病的一种主要病原[5].为进一步研究这些鹅源NDV的生物学特征,探讨其致病机理,我们测定了与NDV致病性和毒力密切相关的囊膜糖蛋白HN的基因序列,并对其进行了比较分析.
关键词： 鹅 新城疫病毒 血凝素-神经氨酸酶基因 序列分析 -
鸽源新城疫病毒JS/07/04/Pi株感染性分子克隆的构建及病毒拯救
参照GenBank上公布的鸽源Ⅵb亚型新城疫病毒JS/07/04/Pi株基因组全序列设计9对引物,RT-PCR扩增目的片段后,依次亚克隆至TVT7/R转录载体,成功构建出含JS/07/04/Pi株基因组全长cDNA的转录载体TVT/071204.然后将其与三个辅助表达质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染BSR-T7/5细胞,60h后将转染细胞及其上清接种鸡胚,收集死亡鸡胚尿囊液进行HA与HI试验.结果显示死亡鸡胚尿囊液HA呈阳性,并能被ND阳性血清所抑制,表明该病毒已成功拯救,且拯救病毒rNDV/071204在细胞上的生长增殖能力同母本病毒相似.该病毒的成功拯救为鸽源Ⅵb亚型NDV感染的宿主特异性及鸽用ND新型疫苗的研究提供了理想的生物材料.
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新城疫病毒感染活化的人肝星状细胞系LX-2
目的 探讨新城疫病毒(NDV)在活化肝星状细胞(HSC)中的复制情况.方法 用转化生长因子β1(TGF-β1)刺激人肝星状细胞LX-2,MTT法检测细胞的增殖率,RT-PCR检测活化相关基因的mRNA表达.用NDFLtag-EGFP感染不同传代的LX-2细胞和原代分离培养以及TGF-β1刺激活化的HSC,荧光显微镜观察NDV在细胞中的复制.用流式细胞术(FACS)检测NDFLtag-EGFP和NDV-Italien在LX-2细胞中的复制.结果 TGF-β1能够刺激LX-2细胞的活化.NDV随着LX-2细胞的连续传代活化以及TGF-β1莉激活化,其在细胞中的复制率也逐渐增加,分别从(15.65±0.92)％增加到(23.05±1.5)％、从(12.8±1.4)％增加到(22.7±1.7)％(P＜0.05).原代分离培养的小鼠HSC,随着细胞的传代次数增加和TGF-β1的刺激,NDV也表现出较高的复制效率.结论 NDV能在活化的HSC中高效复制,LX-2的活化易化了NDV在其中的复制.
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二硝基氟苯修饰的肿瘤疫苗可增强外周血单个核细胞体外杀伤人乳腺癌细胞
抗肿瘤免疫治疗是一种重要的癌症辅助治疗手段,其特点是毒副反应较小,患者耐受性好,并能在相当程度上改善肿瘤的预后.本研究是应用一种小分子半抗原二硝基氟苯(1)NP)修饰细胞瘤苗(TCV),评价该瘤苗是否会增强人淋巴细胞对人乳腺痛(MCF7)和人肺癌(H23)细胞的杀伤效应.此外,我们还把DNP瘤苗修饰法与另一种临床常用的瘤苗修饰法,即应用新城疫病毒Ulster株(NDV Ulster.)的修饰法,进行了抗肿瘤免疫效应方面的比较.
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新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白的可溶性超表达与免疫活性检测
目的 检测新城疫病毒(NDV)血凝素一神经氨酸酶(HN)蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量,及其免疫活性.方法 采用融合表达的方法将HN蛋白基因分别与Grifin、谷胱甘肽S移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Nus A、小泛素样相关修饰物(SUMO)、硫氧还蛋白(thioredoxin)、蛋白G(protein G)、γ-晶状体蛋白(γ-crystallin)、Ars C、Ppi B 10种融合标签基因采用柔性接头进行连接,构建10个重组表达质粒,经酶切及测序鉴定正确后,将这10个重组质粒分别转入大肠杆菌BL21中,用不同条件进行诱导表达,经SDS-PAGE检测并选出佳诱导蛋白表达的条件,筛选出能够显著促进HN蛋白可溶性表达的标签,并用Western blotting对所表达蛋白的含量进行定性分析,同时纯化的重组蛋白用Western blotting和间接ELISA验证其免疫原性.结果 成功构建了10个不同融合标签的HN融合蛋白表达载体,筛选出融合标签麦芽糖结合蛋白(MBP)能够显著促进HN蛋白可溶性表达,且Western blotting显示所表达重组蛋白的表达量是多的.经Western blotting和间接ELISA验证重组HN蛋白具有良好的免疫原性.结论 融合标签MBP可以显著提高HN蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量.
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理化因素对我国新城疫病毒流行株感染力的影响
目的 了解水环境的理化因素对国内新城疫病毒流行株感染力的影响,以及新城疫病毒强、弱毒株对理化因素耐受性差别.方法 测定3株NDV强毒株和3株弱毒株在不同温度(20、37和54℃)、盐度(0、15和30 g/L)和pH(4.4、5.4和7.4)条件下保存时,病毒的鸡胚半数感染量(EID50)随时间的动态变化.使用线性回归方程分析不同理化条件下病毒的感染持续期.结果 对照组用磷酸盐缓冲液(pH7.4和20℃)保存时,病毒EID50保持相对稳定,RT(病毒感染力降低90％所需天数)可达26.25～64.52d;在30 g/L NaC1条件下,病毒RT为5.78～24.51 d;在pH4.4条件下病毒的EID50下降较快,RT在4.54～10.66 d之间;在57℃条件下,病毒的EID50迅速下降,RT＜1 d.NDV强、弱毒株RT值相似.结论 酸度增加和盐度增高可一定程度上缩短病毒在水中的存活时间,而水温增高则导致病毒感染力的迅速降低.病毒对理化因素的耐受力因毒株而异,但与病毒的毒力无关.因此可利用不利于病毒存活的理化因素如高温或化学品进行消毒,减少禽舍或环境中新城疫病毒的存在,阻断病毒传播.
