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新城疫病毒分离株HN和P基因分子进化及其相关研究
为探讨新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)和磷蛋白(P)基因遗传特性以及相互关系,将1997～2005年间国内分离到12株NDV毒株,分别进行HN和P基因克隆测序,结合15个已发表的国内外不同时期的NDV毒株HN和P基因,计算所有毒株HN和P基因的不同核苷酸和氨基酸片段进化距离,利用统计软件进行了不同片段间进化距离的方差分析,HN或P基因核苷酸进化距离与毒株分离时间、HN或P基因片段与其全长间以及HN和P基因全长间的相关分析.统计分析显示:NDV HN或P基因不同核苷酸和氨基酸序列片段变异程度不一样;不同毒株间HN或P基因片段与其全长间以及HN和P基因全长间无论是核苷酸还是氨基酸遗传变异高度相关.以上说明,NDV HN和P基因虽以不同的方式进化,但是HN和P基因遗传变异的趋势是相同的.HN和P基因的变异与分离时间有一定的联系.
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慢病毒介导的靶向NDV P基因shRNA对NDV复制的抑制作用
小干扰RNA(siRNA)诱导的RNA降解可以特异性地抑制病毒感染,它作为一种有效的抗病毒治疗方法正被广泛研究.为了探讨慢病毒介导的shRNA对NDV复制的抑制效果,从而为新城疫病毒的抗病毒研究奠定基础,本研究以新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)P基因为靶基因,构建了靶向NDV P基因的shRNA重组慢病毒表达载体RNAi-341和RNAi-671.将其与辅助细胞共转染293T细胞,获得包装好的重组慢病毒;在鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)和SPF鸡胚上进行了干扰实验,并通过荧光定量PCR和病毒滴度测定检测shRNA对NDV的抑制效果.结果发现,RNAi-341和RNAi-671均能抑制FLAG-P蛋白在293T细胞中的瞬时表达.在CEF细胞感染后16h后,NDV的病毒滴度分别降低了66.6倍和30.6倍;在鸡胚感染48h后,RNAi-341和RNAi-671组NDV病毒的增殖量分别减少99％和98％.RNAi-341与RNAi-671不仅能抑制P基因的转录,还能显著降低NP、M、F、HN和L基因的转录水平.与RNAi-671相比,RNAi-341的抑制效果更好.研究结果表明,慢病毒介导的靶向P基因的shRNA具有抗病毒作用,能够抑制NDV在CEF和鸡胚中的复制,从而为临床防治NDV提供一个新方法.
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我国四株狂犬病毒M和P基因序列分析和所编码蛋白的分析
为了解我国狂犬病毒M、P基因序列和结构特点,用RT-PCR方法获得目的基因片段,测定核苷酸序列后,计算机分析核苷酸和氨基酸序列及其功能区位点结构.结果显示四株病毒M基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.9%～99.5%和93.1%～99%,四株狂犬病毒M蛋白上调节病毒RNA转录和复制功能的第58位氨基酸残基均为谷氨酰胺残基(E),与特异性细胞蛋白WW区域作用的PPxY结构序列均为PPEY保守序列;四株病毒P基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.6%～99.8%和87.2%～99%,P蛋白与胞浆动力蛋白轻链LC8相互作用的序列位于143～148位氨基酸残基,均为DKSTQT,四株病毒P基因与L蛋白、N蛋白作用位点序列显示未发生影响其生物学功能的变异.研究结果证实了这两种蛋白结构在病毒致病性中起重要作用的推论.
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四川省两县(区)乙型肝炎病毒S基因和P基因变异分析
目的 分析四川省两县(区)乙型肝炎(乙肝)病毒(Hepatitis B Virus,HBV)S基因和P基因变异.方法 从乙肝病毒表面抗原、乙肝病毒e抗原均阳性的血清中提取病毒脱氧核糖核酸,经聚合酶链反应和核苷酸测序后,比较和分析S基因和P基因核苷酸和氨基酸变异.结果 47例慢性HBV感染者血清标本中,12份标本在"a"决定簇内出现氨基酸变异(25.53%),分别为T126A、I126T/S、P127T、T131N、M133L、M133T、T140I;变异主要集中在"a"决定簇的第1环上(92.86%,13/14).1份标本逆转录酶C域中出现rtV2071变异.结论 自然发生的氨基酸变异主要集中在"a"决定簇的第1环上,其抗原性已改变,对乙肝疫苗接种人群构成了潜在的威胁.拉米夫定耐药株也可在未接受核苷(酸)类药物治疗的病人中发现.
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新城疫病毒NP和P基因辅助质粒的构建及鉴定
目的 构建新城疫病毒JL02/2000株P和NP基因真核表达质粒,并在BHK-21细胞中表达,为该病毒的反向遗传操作系统的建立奠定了基础.方法 根据新城疫病毒(JL02/2000毒株)的全基因组中的NP、P基因分别设计引物,应用RT-PCR方法扩增NP基因和P基因,将扩增的NP基因和P基因片段连接到pMD18-T载体上,限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切鉴定确认后回收目的条带,分别插入到真核表达载体pCI上,经测序确认pCI-NP、pCI-P辅助质粒的构建.将pCI-NP、pCI-P转染BHK-21细胞,两次换液,72 h后回收细胞,经RT-PCR检测NP和P基因片段. 结果 构建的辅助质粒pCI-NP和pCI-P经双酶切和测序鉴定到目的片段.pCI-NP、pCI-P转染后,RT-PCR检测到NP和P基因片段. 结论 新城疫病毒pCI-NP、pCI-P辅助质粒构建成功,pCI-NP、pCI-P可在BHK-21细胞中表达,为该病毒的反向遗传操作系统的建立奠定了基础.
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眼皮肤白化病Ⅱ型产前基因诊断研究及二种P基因新突变
目的 对1例眼皮肤白化病(OCA)患儿进行基于DNA的分型诊断,并在此基础上进行OCA产前基因诊断.方法 应用PCR技术、DNA序列测定技术和变性高效液相层析(DHPLC)技术,分析患儿及其父母的OCA相关基因,确定患儿的分型诊断和基因型后,于其母孕20周时取羊水,以DNA序列测定技术进行OCA产前基因诊断.结果 先证者TYR基因未见突变,1对P基因分别存在N476D和Y827H突变.群体中100名表型正常者中未见此2种突变等位基因.胎儿获得了母源性N476D突变,未获得父源性Y827H突变,推测胎儿为表型正常的致病基因携带者.胎儿出生后表型正常,与产前基因诊断结果相符.结论 成功开展了1例OCA2产前基因诊断并发现2种致病性P基因新突变N476D和Y827H,对今后开展该病的基础研究和预防与优生工作具有重要意义.
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鹅新城疫病毒P基因的RNA编辑及其相关蛋白的分子特征
应用 RT-PCR方法对鹅新城疫病毒安徽分离株WF00G P基因进行了RNA编辑分析,发现WF00G P基因在保守的编辑位点上插入一个G,使得P基因增加编码V蛋白,而且它的大ORF的长度为1188 bp,编码395个氨基酸的P蛋白.WF00G株和参考毒株的P基因的同源性和系统发育分析表明,WF00G株与水禽源毒株NA-1、ZJ1、FP1/02、PX2/03、Duck/1/05和SF02等亲缘关系较近,与传统疫苗株或弱毒株HB92、LaSota和Clone30以及F48E9等的亲缘关系相对较远.进一步对其V蛋白羧基端序列分析发现,虽然编辑位点氨基酸序列(132KKG134)和羧基端的5个Cys残基位点是高度保守的,但是V蛋白C末端氨基酸存在较大变异,APMV-1毒株V蛋白羧基端氨基酸的突变呈现"基因型一致性".
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HBV反转录酶A181位点变异与临床耐药的关系
目的 分析核苷(酸)类似物(NA)疗程中HBV反转录酶(rt)A181位点的变异与临床耐药的关系.方法 对5例rtA181位点变异的慢性HBV感染患者做回顾性调查与随访,对比核苷类似物治疗前后的病毒学及肝功能生化应答情况. 结果 在85例HBV反转录酶测序中发现5例rtA181位点变异,5例中2例发生rtA181V变异,2例发生rtA181T变异,1例发生rtA181S变异,均未出现rtN236T及YMDD(rtM204)变异,其中4例与临床耐药相关. 结论 rtA181V/T/S变异与NA治疗中的耐药有关.
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P基因的研究进展
人类P基因与小鼠的红眼缺失基因同源,定位于15q11～q13,与人类的色素生成有关,人类该基因的缺失或点突变可导致多种色素障碍性疾病如Ⅱ型白化病等,对人类P基因结构、核苷酸序列、多态性、突变和缺失以及编码蛋白的研究,有利于阐明色素障碍性皮肤病的分子发病机制,为临床基因治疗提供依据.
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1012例乙肝病毒患者HBV P区基因位点变异分析
目的 研究人群中乙肝病毒(HBV)P区位点突变发生的频牢和特点.方法 通过高保真PCR扩增1012例乙肝病毒患者HBV的P区基因片段,采用双脱氧末端终止法进行测序,分析HBV P区169、173、180、181、184、194、202、204、233、236和250共11个位点的变异情况.结果 HBV P区204和180位点突变频率较高;其次是181和236位点;其余位点突变频率很低.在男性患者中,204位点和180位点突变率相对较高;女性患者中存在同样的情况.30岁以下患者与31至60岁患者相比较,181位点变异率差异较大(P<0.01).其余无显著差异(P>0.05).结论 HBV P区位点突变主要集中在180、181、204和236位点.不同性别的患者中,HBV P区基因突变率尚不具有统计意义上的显著差异.不同年龄段的患者中,HBV P区181位点的突变率具有极显著差异.通过测序技术检测P区位点的突变,可以全面反映P区位点的变异情况,为临床用药和抗病毒新药研发提供重要依据.
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我国分离的10株狂犬病病毒P和M蛋白基因序列分析
目的 探讨我国狂犬病病毒P、M蛋白基因序列的结构特点及变异情况.方法 用RT-PCR方法从分离的10 株具有代表性的狂犬病病毒中获得目的 基因片段,测定核苷酸序列后,利用生物信息学软件分析核苷酸、氨基酸序列及其相关的功能位点并构建P、M蛋白基因的系统发育树.结果 10 株病毒P和M基因核苷酸序列同源性分别为85.9%～99.4%和89.5%～99.5%,推导出的氨基酸同源性分别为92.3%～100%和96.0%～99.5%.在核苷酸及氨基酸水平上,10 株病毒与我国分离的街毒株HN10及CTN疫苗株的P、M基因同源性均明显高于国外其它疫苗株、标准攻击毒CVS株相应的同源性.系统发育分析表明,10 株病毒与我国湖南街毒株、CTN疫苗株进化关系近,而与研究中选取的其他毒株进化关系较远.氨基酸对位分析表明,与其它基因1型毒株相比,本研究中10 株狂犬病病毒的P、M基因出现多处变异,但很少在功能区发生变异.结论 分离的10 株病毒属基因l型狂犬病病毒,与我国分离的街毒株及CTN疫苗株关系较近.
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狂犬病病毒P基因的原核表达及间接ELISA方法的应用
目的 以狂犬病病毒P蛋白作为检测抗原,用间接ELISA方法检测狂犬病病毒抗体.方法 根据GenBank发表的狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)LEP-Flury株的基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增出P基因的全长序列,克隆于pGM-T载体中,获得重组质粒pGM-T-P,将重组质粒用限制性内切酶NotI和EcoRI进行双酶切,酶切产物定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核重组表达质粒pET-32a-P,阳性重组质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达.SDS-PAGE和Western-blot分析确定蛋白表达量和特异性.用纯化的蛋白作为诊断抗原,通过对反应条件的优化,初步将间接ELISA方法应用于狂犬病病毒抗体的检测中.结果 扩增RV P基因,构建了克隆质粒pGM-T-P、原核表达质粒pET-32a-P,高效表达了主要以可溶性形式存在的P蛋白,并能与RV阳性血清发生特异性反应.用表达的狂犬病病毒重组P蛋白建立了用于RV抗体检测的间接ELISA方法.结论 成功表达了磷蛋白,用其作为固化抗原以间接ELISA方法检测RV抗体.
关键词： 狂犬病病毒LEP-Flury株 P基因 P蛋白 原核表达 间接ELISA -
河南省8株狂犬病毒磷蛋白基质蛋白基因分析
目的 分析河南省8株狂犬病毒磷蛋白P及基质蛋白M的基因序列,探讨狂犬病毒流行株毒力与致病性变异的可能原因.方法 以免疫荧光法检测2006年采自河南省的121份犬脑,取阳性犬脑组织悬液接种鼠脑分离病毒,以RT-nestedPCR法扩增病毒P与M基因,克隆测序后进行生物信息学分析.结果 分离到8株狂犬病毒,序列分析表明8株病毒均为基因1型狂犬病毒,8株病毒彼此之间P基因与M基因核苷酸序列同源性均为98.9%～99.8%,推导的氨基酸序列同源性分别为98.0%～99.3%和97.0%～99.5%.8株病毒与我国宁夏分离株CNX8511、CNX8601的同源性高,P基因与M基因核苷酸同源性分别为89.1%～89.7%和91.1%～92.0%,氨基酸同源性分别为93.3%～94.3%和96.6%～98.0%.在核苷酸及氨基酸水平上,8株病毒与CTN疫苗株的P与M同源性均明显高于与其它疫苗株的相应同源性.系统发育分析表明,8株病毒与我国宁夏街毒株、CTN疫苗株、泰国及菲律宾等东南亚株进化关系近,而与CTN以外的其它疫苗株、标准攻击毒CVS株,以及我国80年代初分离的DRV、MRV株进化关系较远.氨基酸对位分析表明,较之参比的其它基因1型毒株,河南省8株狂犬病毒的P与M出现多处变异.结论 8株狂犬病毒仍属基因1型狂犬病毒,但其P基因及M基因在核苷酸及推导的氨基酸水平上均出现了明显变异.
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广西16株狂犬病毒P基因序列分析
目的 分析广西16株狂犬病毒P基因序列特点,探讨广西狂犬病高发的可能原因.方法 2005-2008年在广西14个市采集健康犬脑标本3 961份,用直接免疫荧光法(DFA)和RT-PCR法检测狂犬病毒,P基因PCR扩增阳性者进行序列测定和分析.结果 16株狂犬病毒完成P基因序列测定,核苷酸及氨基酸同源性分别为86％～100％和93％～100％,属于基因Ⅰ型狂犬病毒;广西境内至少存在3条狂犬病毒传播链;16株狂犬病毒P基因序列推导的氨基酸序列多个位点发生变异.结论 广西存在多个Ⅰ型狂犬病毒株系的流行,可能是近几年广西狂犬病持续高发的原因之一.
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拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者HBV P基因区突变序列分析
目的 探讨拉米夫定耐药慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV P基因逆转录酶区(RT区)序列突变特点.方法 收集115例接受拉米夫定治疗的CHB患者的临床资料,采用PCR产物直接测序法检测HBV P基因RT区序列耐药变异.结果 人选的115例患者中103例检测到拉米夫定基因型耐药变异,主要的耐药变异模式为rtL180M+rtM204V和rtM204I,分别占58.3％和22.3％,其他耐药位点包括rtL80V/I、rtT184S和rtA200V,并在5例患者中检测到RT区3个位点的联合变异.结论 对拉米夫定治疗患者的耐药检测除了HBV P基因区常见的rtL180和rtM204位点变异外,还应考虑其他位点的联合耐药变异.
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湖南狂犬病毒P基因和M基因分子遗传特征
目的 了解湖南省狂犬病毒的分子流行病学特征以及其与疫苗株的差异. 方法 对4株湖南狂犬病病毒P和M基因同时进行了RT-PCR扩增、克隆和测序. 结果 同源性分析表明,4株湖南街毒P和M基因核苷酸同源性分别为97.3%～99.4%和98.4%～99.8%;与其它I型狂犬病病毒和疫苗株核苷酸同源性比较.P基因分别为78.4%～90.2%和81.8%～86.8%;M基因的分别为81.8%～92.1%和84.7%～90.6%.4株野毒P和M基因氨基酸同源性分别为98.0%～99.3%和98.5%～99.0%. 结论 4株病毒P基因和M基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与我国现用的人用及兽用疫苗株存在一定差异.进化关系表明,4株病毒均为基因I型狂犬病毒;与我国宁夏分离株近;与其它I型毒株分离自菲律宾和泰国等东南亚的毒株亲缘关系较近;而与翼手目的 毒株关系远.
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40例慢性乙型肝炎患者血清HBV P基因变异及突变频率检测
目的 观察核苷(酸)类药治疗不同时间段慢性HBV感染患者血清乙型肝炎病毒聚合酶(HBV P)基因序列变异特点及突变频率.方法 运用焦磷酸测序仪器配套的软件Assay Design SW在目的区域两端保守区域设计PCR引物及测序引物,采用套式PCR方法检测血清中HBV-DNA,按照PyroMark ID遗传分析系统用SNP模式进行PCR产物HBV相关位点的焦磷酸测序；40例慢性HBV感染患者进行P基因变异、突变频率检测的同时测定HBV-DNA、HBV M、ALT.结果 40例患者中18例发生变异,变异模式以经典突变L180M、M204V/I、A181V/T、N236T突变为主,加少量V173L、S202G突变；发生变异者耐药突变型在样本中所占比例由20％到100％；HBV P基因变异可以在HBV-DNA、ALT发生突破前、中、后检出；HBeAg、HBeAb阳性者P基因变异率分别为46.2％(12/26)、41.7％(5/12) (P＞0.05),两例HBeAg、HBeAb均阴性者中1例P基因区变异.结论 焦磷酸测序可以快速、准确的检测出HBV P基因变异；HBV P基因变异模式、突变频率与核苷类药物敏感性密切相关.
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眼皮肤白化病Ⅱ型产前基因诊断二例
目的 对生育过眼皮肤白化病(oculocutaneous albinism,OCA)患儿的2个家系进行基因诊断分型,并在此基础上提供产前基因诊断.方法 采用PCR扩增先证者OCA1型疾病相关TYR基因的所有5个编码外显子和OCA2型疾病相关P基因的所有23个编码外显子,PCR产物直接测序,在确定致病突变的基础上对家系成员进行综合分析.结果 两例OCA先证者均未检测到TYR基因的致病突变,但均携带P基因的复合杂合突变,因此确定2例均为OCA2型患者.P基因共检测到4种突变:c.406C＞T、c.535A＞G、c.808-2A＞G和c.2180T＞C,其中c.535A＞G和c.808-2A＞G为新突变.2个家系的第1次产前诊断均提示胎儿基因型与先证者一致,家属选择终止妊娠.第2次产前基因诊断,2个家系中1例胎儿为P基因c.808-2A＞G携带者,另1例为P基因野生型携带者.两名孕妇均继续妊娠至足月分娩,新生儿随访均正常.结论 应用基因检测可为眼皮肤白化病患者提供确切的临床分型,并在此基础上提供有效的产前基因诊断.
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三例眼皮肤白化病患者TYR和P基因的突变分析
目的 分析眼皮肤白化病(oculocutaneom albinism,OCA)患者酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因和P基因的基因突变.方法 应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction ,PCR)和变性高效液相色谱(de-naturing high-perfomanee liquia chromatography,DHPLC)技术对3例患者的眼皮肤白化病Ⅰ、Ⅱ型相关基因(TYR和P基因)的外显子进行突变检测,并对DHPLC检出的突变样本进行测序和限制性内切酶分析以验证该突变.针对未见报道的新突变,筛查100名表型正常的无关个体,排除多态的可能.结果 在3例患者中检测出两种P基因突变,未检测到TYR基因突变.其中,患者1的P基因第13外显子发生杂合突变T450M;患者2的P基因发生两个杂合突变,分别是第13外显子T450M和第23外显子G775R;患者3的P基因第23外显子发生杂合突变G775R.P基因第13外显子限制性内切酶分析显示,患者1、2均出现杂合突变T450M导致的Oli I酶切位点部分消失,100名表型正常的无关个体未检出该突变;经检索,T450M为一未见报道的新突变.结论 联合应用PCR、DHPLC、DNA测序和限制性内切酶分析的方法可有效的对白化病进行基因诊断.
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一个近亲婚配家系中的一种P基因新突变
目的 在DNA水平上对1个有2例患者的姨表兄妹近亲婚配家系中的眼皮肤白化病患者进行分型诊断.方法 用PCR扩增先证者P基因及TYR基因各外显子、外显子-内含子交界区及3′端和5′端非翻译区,以DNA序列测定技术检测基因突变,以DNA测序技术和限制性内切酶酶切法检测该家系其他成员及群体中正常人的相应基因位点. 结果 先证者和其白化病妹妹为P基因A787T突变纯合子,其父母和表型正常的弟弟均为A787T突变杂合子.先证者TYR基因未见突变.群体中102名表型正常者中无A787T突变等位基因. 结论 在基因水平确定我国存在眼皮肤白化病Ⅱ型,同时发现了一种P基因病理性新突变.
