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云南省2007-2009年流行性腮腺炎病毒SH和HN基因的遗传特征分析
目的 分析2007-2009年云南省腮腺炎病毒(MuV)分离株的SH和HN遗传特征.方法 采用反转录-聚合酶链反应从Vero细胞分离的病毒株基因组中扩增出SH基因和HN基因,测序后用Mega4.1软件分析其遗传特征.结果 云南省分离14株MuV的SH基因其核苷酸和氨基酸同源性为98.3%～100.0%和96.5%～100.0%,与其他省份比较其同源性为92.6%～99.4%和87.7%～100.0%,其中Wsh1和Wsh2与其他F基因型差异较大;与疫苗株同源性为84.5%～85.1%和77.2%;与其他基因型同源性为83.4%～90.9%和70.1%～86.0%.6株MuV分离株的HN基因与核苷酸和氨基酸同源性分别为99.3%～99.5%和99.1%～99.7%;与中国分离株SP株的核苷酸和氨基酸同源性均为99.8%;与其他基因型同源性为94.7%～96.8%和95.5%～99.1%;与疫苗株的同源性为92.4%～93.2%和95.5%～96.4%.结论 2007-2009年云南省流行的MuV均为F基因型;其HN基因比SH基因保守.
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抗体选择压作用下新城疫病毒HN和F基因的演化及其抗原性变异的比较分析
TZ060107株新城疫病毒(NDV)在含有对它抗体的鸡胚成纤维细胞(CEF)培养上分3个独立系列连传50代,每10代扩增其HN和F基因并测序.选择变异大的系列A1-50病毒,再在含有抗A1-50抗体的CEF培养上分3个独立系列连续传50代,同时设3个不带抗体的独立传代系列作为对照.对第60、70、80、90、100代病毒的HN和F基因序列比较结果显示,有抗体组HN基因的非同义突变(NS)对同义突变(S)比值NS/S为5.25,明显高于无抗体组NS/S的2.375.前50代在抗体选择压作用下已发生的稳定NS突变在含有抗A1-50抗体的细胞培养中传代仍能稳定保持,且又出现了一个新的稳定的NS突变位点.在有抗体组经传50代后F基因发生的稳定非同义突变,在抗A1-50血清作用下再连传50代后也仍然保持,且又出现3个新的稳定的NS突变.不同传代病毒与原始病毒间的血清交叉血球凝聚抑制试验结果表明,随着在含有抗NDV血清的细胞培养上传代代数的增加,病毒与原始病毒间在抗原性的差异越来越大.
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2009～2011年甘肃省和陕西省流行的人副流感病毒3型基因特征分析
为了解我国甘肃省、陕西省流行的人副流感病毒3型(Human parainfluenza viruse-3,HPIV-3)的基因特征和流行规律,2009～2011年从上述两省急性呼吸道感染患者中共采集咽拭子标本719份,采用多重反转录聚合酶链反应(Multiplex reverse transcription polymerase chain reaction,多重RT-PCR)方法对常见呼吸道病毒性病原体进行筛查,HPIV-3阳性标本再用巢式PCR(nested polymerase chain reaction,nested PCR)扩增其血凝素-神经氨酶蛋白(Hemagglutinin-neuraminidase,HN)基因,进行序列测定和基因分析.共获得13株HPIV-3 HN基因序列,均属于C3亚群,核苷酸差异和氨基酸差异分别为0.2％～2.3％和0～1.1％.与美国、加拿大和澳大利亚的HPIV-3的HN基因序列之间的核苷酸差异和氨基酸差异较大,大分别为6.0％和3.4％.shaanxi09 2与shaanxi10H0091、shaanxi10-H0055与gansu11-62110372和shaanxi09-2与BJ/291/09之间存在核苷酸差异分别为0.9％、0.5％和0.6％,但均无氨基酸差异.提示甘肃和陕西两省在不同年份之间存在HPIV-3的持续循环传播.引起2009～2011年甘肃和陕西两省HPIV-3流行的毒株属C3亚群.
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禽Ⅰ型副粘病毒各种禽源分离株毒力及其相关基因的研究
用测定新城疫病毒(NDV)毒力的经典方法,即鸡胚平均死亡时间(MDT)和脑内接种致病指数(ICPI),对源于鸡、鸽、鹅、珍珠鸡、孔雀、鹌鹑和画眉鸟等7种禽(鸟)源的共14个禽Ⅰ型副粘病毒(APMV-1)广西分离株,分别测定了毒力.同时对分离株F基因的N-端前段和HN基因的C-末端片段进行扩增、测序和分析,并绘制系谱树.结果发现,分离株的MDT在36h～75h之间,除1株鸽源毒株gxp22的ICPI值为0外,其余分离株在1.09～1.95之间;除孔雀源的分离株gxpc52在F基因裂解位点附近的氨基酸序列为112R-R-Q-R-R-F117之外,其它13株均为112RR-Q-K-R-F117,都符合强毒株的特征.所有分离株与国内参考强毒株F48E8和国外参考强毒株HER/33在HN基因C-末端终止密码子的位置相同,也符合强毒株的特征.根据F基因核苷酸序列绘制的系谱树发现,近几年来在广西流行的APMV-1毒株的基因型为Ⅶd亚型;根据HN基因核苷酸序列绘制的系谱树表明,广西各种禽源APMV-1分离株可分为2个群.研究的结果表明,根据F基因裂解位点附近的氨基酸序列和HN蛋白翻译的终止密码子的位置判定APMV-1毒力的结果,都与毒株在临床上的致病情况相符.因此,根据F基因和HN基因序列和结构的特征,均可以判定APMV-1临床分离株的体内致病性.
关键词： 禽Ⅰ型副粘病毒(APMV-1) 毒力测定 F基因 HN基因 系谱树 -
新城疫病毒分离株HN和P基因分子进化及其相关研究
为探讨新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)和磷蛋白(P)基因遗传特性以及相互关系,将1997～2005年间国内分离到12株NDV毒株,分别进行HN和P基因克隆测序,结合15个已发表的国内外不同时期的NDV毒株HN和P基因,计算所有毒株HN和P基因的不同核苷酸和氨基酸片段进化距离,利用统计软件进行了不同片段间进化距离的方差分析,HN或P基因核苷酸进化距离与毒株分离时间、HN或P基因片段与其全长间以及HN和P基因全长间的相关分析.统计分析显示:NDV HN或P基因不同核苷酸和氨基酸序列片段变异程度不一样;不同毒株间HN或P基因片段与其全长间以及HN和P基因全长间无论是核苷酸还是氨基酸遗传变异高度相关.以上说明,NDV HN和P基因虽以不同的方式进化,但是HN和P基因遗传变异的趋势是相同的.HN和P基因的变异与分离时间有一定的联系.
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新城疫分离毒HN基因的分子特性和片段同源相关性
选取国内1997～2005年分离的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)24株,经蚀斑纯化克隆其血凝素-神经氨酸酶(HN)基因,与在GenBank发表的36株国内外不同时期的NDV毒株,进行氨基酸遗传变异分析,并利用SPSS8.0软件对其不同片段的氨基酸进行同源相关比较.结果显示:国内所有NDV分离毒株氨基酸高度同源,同源性为94.4%～99.4%;与LaSota、Clone30疫苗株等的氨基酸同源性为86.9%～89%;与强毒株F48E9的氨基酸同源性为87.9%～89.9%;与国外NDV的氨基酸同源性为87.2%～96.2%.系统发育分析表明:国内NDV分离毒HN遗传距离较近,而与LaSota、Clone30和F48E9遗传距离较远.国内NDV分离毒均缺乏538～540位糖基化位点.不同片段与全长的氨基酸同源性高度相关,且与前80个氨基酸相关密切.
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鹅Ⅰ型禽副粘病毒GPMV/QY97-1株HN基因的克隆和序列分析
在华南地区进行鹅病病因的调查过程中,从患病鹅群中分离到一株对鹅和鸡都有致病力的病毒,初步判定该病毒属于Ⅰ型禽副粘病毒,命名为GPMV/QY97-1株.以GPMV/QY97-1毒株的基因组RNA为模板,通过RT-PCR方法,扩增出血凝素-神经氨酸酶(HN)基因3′端和5′端的cDNA片段,分别将其克隆至pGEM-T Easy载体中,对其进行序列测定.序列分析表明,HN基因的cDNA全长为2 024nt,编码571个氨基酸.序列中含有13个半胱氨酸残基和6个潜在的糖基化位点,其HN基因及编码蛋白结构与新城疫病毒株相符.将GPMV/QY97-1株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫病毒株的HN基因相应序列做比较后发现,它们的核苷酸序列同源性分别在89.6%～83.6%,氨基酸序列同源性在93.3%～87.9%.在同源性比较的基础上,进一步绘制了Ⅰ型禽副粘病毒株HN基因的系统发育树.这对于Ⅰ型禽副粘病毒毒力基因的功能分析和该病的分子流行病学调查有着重要意义.
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2018年福建省1起流行性腮腺炎暴发疫情的病原学鉴定及基因特征
目的 对 2018年福建省漳州市1起流行性腮腺炎(流腮)暴发疫情进行病原学鉴定,分析腮腺炎病毒(Mumpsvirus,MuV)的基因型特征.方法 采用细胞培养和RT-PCR对该起暴发中疑似流腮病例的咽拭子标本进行MuV分离和型别鉴定;应用序列分析软件分析MuV分离株的SH和HN基因特征.结果 从该起暴发的17例疑似流腮病例的咽拭子标本中分离获得5株MuV毒株基因序列.这5株MuV分离株同属于F基因型,与中国其他省份F基因型毒株、疫苗株(Jeryl-Lynn和S79)相比,在SH基因上分别存在2个、12个氨基酸位点差异,在HN基因上分别存在4个、29个氨基酸位点差异.分离株464位点的变异导致在464-466位上增加1个N-糖基化位点,位点121、122、123、279、287、336、356和442的变异发生在HN基因已知抗原的相关位点上.分离株在HN基因上出现3个新变异位点(M58T、S271F和I435M).结论 该起流腮暴发疫情是由F基因型MuV引起的,且该F基因型MuV可能出现了新变异.
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新城疫病毒HN基因对肿瘤抗原诱导的抗肿瘤免疫的增强作用
目的了解新城疫病毒HN基因增强肿瘤抗原诱发的抗肿瘤免疫反应的作用,并对其作用机制进行探讨. 方法将构建的HN基因-癌胚抗原(CEA)cDNA共表达质粒(pcD-CEA/HN)免疫小鼠,通过淋巴细胞增殖实验、NK细胞活性检测了解HN对抗CEA免疫反应的影响;并以免疫组化的手段追踪HN质粒表达产物在体内组织的分布,以及HN质粒对荷瘤小鼠肿瘤生长、抗肿瘤免疫反应的影响. 结果 (1)共表达质粒pcD-CEA/HN免疫小鼠获得了较其他对照组强的淋巴细胞增殖指数及NK细胞活性.(2)HN质粒在肌肉、肿瘤组织有明显的表达.(3)HN质粒对肿瘤生长具有一定的抑制作用,并能增强荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫. 结论新城疫病毒HN基因对肿瘤抗原诱导的抗肿瘤免疫具有增强作用.
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新城疫病毒HN基因诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡的作用机制
目的探索含新城疫病毒(NDV) HN基因的质粒pVHN诱导人肝癌细胞SMMC7721凋亡的作用及其机制.方法以脂质体介导方法在体外转染pVHN于SMMC7721细胞24 h后,通过MTT方法检测细胞活性状态;采用流式细胞仪(FCM)检测法,通过碘化丙啶(PI)染色测定细胞死亡率; 以罗丹明123染色测定线粒体跨膜电位(△Ψ)的改变;提取细胞基因组DNA进行电泳,检测DNA有无断裂;用底物颜色反应检测Caspase-3活性.结果细胞SMMC7721在体外转染pVHN后,死亡率达 50.0%(转染空载体质粒对照组为5.2%);细胞基因组DNA呈梯状谱带;线粒体△Ψ下降,Caspase-3活性明显升高.结论新城疫病毒HN基因在体外转染细胞SMMC7721,能明显诱导细胞SMMC7721凋亡,其发生机制可能是由于HN基因的导入引起线粒体△Ψ下降,进而激活Caspase-3使细胞凋亡.
关键词： 新城疫病毒 HN基因 人肝癌细胞SMMC7721 凋亡 -
鹅副粘病毒WF00G分离株HN蛋白基因的测序与序列分析
用鹅副粘病毒凤阳分离株WF00G做9～10日龄SPF鸡胚的尿囊腔接种,成功增殖了该病毒,采用一步法RT-PCR技术扩增WF00G病毒的HN基因,获得了1条约1.8 kb的特异性条带.PCR产物回收纯化后测序.测序结果表明,扩增片段大小为1844 bp,含有1个1716 bp的开放性阅读框,编码571个氨基酸.核苷酸同源性分析表明:WF00G株与其他12株鹅副粘病毒的同源性为89.9%～99.2%,与国内外其他NDV HN基因的同源性为81.7%～95.7%,其中与国内标准强毒株F48E9的同源性为84.7%,说明WF00G与国内外的传统毒株有较大变异.与Taiwan95株和NL/96株的同源性为94.3%和95.7%,说明WF00G与Taiwan95株和NL/96株亲缘关系较近,具有较高的相似性.
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含新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因重组腺病素的构建及鉴定
目的:构建表达新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶(Hemagglutinin-neuramidinase,HN)基因的重组腺病毒,为进一步研究HN基因对消化道肿瘤的抑制作用及分子机制建立基础.方法:用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切质粒pVHN,将获得的HN基因片段连接入穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA,构建含HN基因的穿梭质粒pacAd5-HN.利用PacⅠ单酶切对pacAd5-HN和腺病毒基因组质粒(pAd5)进行线性化处理后应用脂质体介导法共转染AAV-293细胞,分别利用蚀斑纯化和RT-PCR、Western blot等方法对重组病毒进行筛选和鉴定,并测定所获得重组病毒的滴度.结果:所构建重组病毒可有效表达HN基因,表达产物分子量约为63 kD,重组病毒滴度为108～1010 PFU/ml.结论:成功构建含HN基因的重组腺病毒,所获得重组病毒的滴度可以满足体内外实验要求.
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新城疫病毒HN基因重组体对人胃癌细胞BGC-823凋亡作用机制研究
目的本实验研究旨在探讨含新城疫病毒HN基因的重组质粒对人胃癌细胞BGG-823凋亡的联合作用机制.方法将含有HN基因的重组质粒pIRVP3IL-18HN经脂质体介导转染人胃癌细胞BGC-823,通过MTT方法检测细胞活力;电镜下观察细胞形态;罗丹明123和DCFA染色测定线粒体跨膜电位(△ψ)和活性氧(ROS)水平变化;底物染色反应检测Caspase-3活性.结果重组质粒pIRVP3IL-18HN转染人胃癌细胞BGC-823后,MTT法结果显示致肿瘤细胞死亡率升高,细胞活力下降;电镜观察肿瘤细胞呈现明显凋亡状态;与阴性空白质粒对照显示,线粒体△ψ下降,ROS水平升高;Caspase-3活性被激活.结论含新城疫病毒HN基因的重组质粒可以诱导人胃癌细胞BGC-823进入特定的凋亡程序,从而导致人胃癌细胞BGC-823的凋亡.
关键词： 新城疫病毒 HN基因 重组质粒 人胃癌细胞BGC-823 凋亡 -
NA-1株鹅源副粘病毒M、F和HN蛋白基因的真核表达
目的 获得鹅源副粘病毒(GPMV)NA-1株M、F和HN基因真核表达蛋白.方法 将NA-1株GPMV经SPF鸡胚增殖、纯化,提取病毒基因组RNA.参考GenBank登录的NA-1株GPMV基因组序列,设计3对特异性引物,利用RT-PCR法,分别扩增M、F和HN基因开放阅读框(ORF),将目的基因克隆至pMD18-T-Simple载体,并进行酶切和序列测定.将目的 片段克隆至pCI-neo表达载体,酶切鉴定正确的重组质粒,分别命名为pCI-M、pCI-F和pCI-HN.将重组表达质粒分别转染Vero细胞,用间接免疫荧光试验鉴定目的蛋白的表达.结果 RT-PCR法分别扩增出M、F和HN基因,大小与预期一致.克隆载体及表达载体酶切及测序鉴定正确;重组真核表达质粒转染Vero细胞后,荧光显微镜下可见特异性荧光.结论 利用pCI-neo真核表达载体在Vero细胞中成功表达了NA-1株 GPMV M、F和HN基因,为下一步研究该病毒的出芽机制以及各结构蛋白的功能奠定了基础.
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人3型副流感病毒HN基因的克隆、表达及其免疫原性
目的 克隆人3型副流感病毒(HPIV-3)HN基因,构建原核表达质粒,并检测表达蛋白的免疫原性.方法 从呼吸道感染患儿呼吸道分泌物中提取HPIV-3 RNA,用套式RT-PCR扩增HN基因,克隆至pGEM-T载体上,进行核苷酸序列分析,并用生物信息软件分析HN蛋白的二级结构,构建截短的HN基因原核表达载体pET-28a-HN,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达蛋白经SDS-PAGE和Western blot检测后,进行纯化和复性.并以此蛋白免疫昆明小鼠,检测小鼠血清中HN抗体效价.结果 扩增出的HPIV-3的HN基因核苷酸序列与参考序列的同源性为95%,氨基酸序列同源性为97%,有16处发生了突变.截短的HN基因的原核表达载体经酶切鉴定及测序,证明构建正确.重组HN蛋白的表达量占菌体总蛋白的30%以上,且具有良好的反应原性.复性的重组HN蛋白免疫的小鼠可产生高效价的抗HN抗体.结论 原核表达的截短的HN蛋白具有良好的免疫原性,能够刺激小鼠产生较高水平的抗体应答.
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新城疫病毒 F48E8株 HN基因在杆状病毒系统中表达
目的采用新型杆状病毒表达系统(Bac to Bac系统)在昆虫细胞Sf-9中进行新城疫病毒F48E8株 HN基因表达.方法 NDV F48E8株 HN基因插入到转座载体 pFast Bac Ⅰ,构建重组转座载体 pFast HN,转化到感受态细胞 DH10后,将目的基因转座到穿梭载体Bacmid中,经筛选获得重组 Bacmid HN 转染到Sf-9昆虫细胞,并进行检测.结果表达产物经 SDS-PAGE、Western blot 检测获得蛋白特异带,相对分子质量约63000.结论 NDV F48E8株 HN基因能通过新型杆状病毒表达系统在昆虫细胞Sf-9中进行表达,表达量约为细胞总蛋白的10%.
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上海市某医院急性呼吸道感染儿童中人3型副流感病毒的检测及进化树分析
目的 了解3型副流感病毒(HPIV-3)的流行特点,以期为制定防制措施提供科学依据.方法 2009年6月到2010年6月上海交通大学医学院附属新华医院送上海市公共卫生临床中心检测的急性呼吸道感染患儿的鼻咽分泌物标本164份,反转录PCR法检测标本中的HPIV-3.对5份阳性标本的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因编码区全长(1 719 bp)进行基因序列测定和进化分析.两组间比较采用精确卡方检验(双侧).结果 164份急性呼吸道感染患儿标本中HPIV阳性数为70份,其中HPIV-3阳性23份,阳性率为32.86％.感染多发生于春、夏季,且多数HPIV-3感染发生在13～36个月的患儿中.基于HN基因建立的系统进化树将5株上海分离株和36株来自不同国家和地区的参考株序列分成3个进化群(A、B和C).5株上海株和5株北京分离株归属于C3a群,上海株之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.0％～99.5％和99.7％～100.0％.结论 HPIV-3在此次急性呼吸道感染患儿中所占比例较高,株系主要为C3a群,其进化很可能具有区域相关性.
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表达新城疫病毒HN基因重组鸡痘病毒的构建及其抑瘤作用
目的: 构建表达新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)HN基因的重组鸡痘病毒vFVHN,探讨vFVHN对体外培养人肝癌细胞 SMMC7721的抑制作用和对小鼠荷肝癌模型的体内抑瘤效果.方法: 以野生型鸡痘病毒(fowl poxvirus, FPV)282 E4株为载体,构建表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒vFVHN.采用5-溴-2-脱氧尿苷(5-bromo-2-deoxyribouridine,BrdU)加压法筛选重组体,并通过RT-PCR和Western blot等方法对其进行鉴定.采用噻唑蓝(methylthiazoletetrazolium,MTT)染色法检测vFVHN对人肝癌细胞SMMC7721的杀伤率,并通过检测抑瘤率观察其在C57BL/6小鼠荷肝癌模型的抑瘤效果.结果: 成功构建重组鸡痘病毒vFVHN,其对SMMC7721细胞的杀伤率为43.37%,对C57BL/6小鼠肝癌模型的抑瘤率为20.65%.结论: 重组鸡痘病毒vFVHN可有效杀伤体外培养的人肝癌细胞SMMC7721,并对C57BL/6小鼠荷肝癌模型体内的实体肿瘤有一定抑制作用.
关键词： 重组鸡痘病毒 HN基因 肝癌细胞SMMC7721 -
华南地区新城疫病毒HN基因的克隆及其系统发育分析
用RT-PCR一步法扩增了华南地区NDV野毒HN基因, 并对其中的3株的HN基因897bp片段进行了克隆、测序及同源性分析.本试验还对该毒株的系统发育情况进行了分析:中国华南地区NDV各毒株与欧美国家Ⅰ至Ⅴ基因型明显分离,遗传关系较远.台湾省的NDV各毒株归属为一型,并且与华南株的遗传距离较近.NDV华南FS1株不能归类到任何一个基因型中.广东地区从鹅群中分离到的副粘病毒GPMV株与我们从鸡体中获得的NDV FS2株有很近的亲缘关系.
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人副流感病毒广州分离株ZYMgz01全基因组序列测定及分析
目的 探讨广州地区副流感病毒的基因组结构和基因型.方法 参照GenBank副流感病毒(U51116)全基因组序列设计11对引物,覆盖副流感病毒基因组的全长.以副流感病毒cDNA为模板分段扩增病毒基因组的全长,各片段克隆到T载体上,并进行序列测定和分析.结果 人副流感病毒ZYMgz01株全基因组核酸序列为15 462 bp,提交到GenBank的序列号为EU326526,与3型副流感病毒保守基因同源性为94.0％,具有3型副流感病毒的结构特征.基因组序列同源性比较结果显示,ZHYMgz01株病毒与兰州的LZ22 (FJ455842)病毒株的同源性高,为99.1％；与美国突变病毒株(U51116)同源性为95.1％；与美国病毒株(Z11575)同源性为95.2％;与日本(AB012132)病毒株的同源性为94.8％,而与加拿大(EU424062)病毒株的同源性为94.8％.系统进化树显示ZHYMgz01病毒株与兰州的LZ22病毒株同属一个进化分支.结论 广州地区儿童呼吸道感染的副流感病毒ZHYMgz01全基因组为15 462 bp,与3型副流感病毒的同源性高,确定ZHYMgz01是3型副流感病毒.3型副流感病毒系统进化可能与地域差异有一定的关系.
