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新城疫病毒NP和P基因辅助质粒的构建及鉴定
目的 构建新城疫病毒JL02/2000株P和NP基因真核表达质粒,并在BHK-21细胞中表达,为该病毒的反向遗传操作系统的建立奠定了基础.方法 根据新城疫病毒(JL02/2000毒株)的全基因组中的NP、P基因分别设计引物,应用RT-PCR方法扩增NP基因和P基因,将扩增的NP基因和P基因片段连接到pMD18-T载体上,限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切鉴定确认后回收目的条带,分别插入到真核表达载体pCI上,经测序确认pCI-NP、pCI-P辅助质粒的构建.将pCI-NP、pCI-P转染BHK-21细胞,两次换液,72 h后回收细胞,经RT-PCR检测NP和P基因片段. 结果 构建的辅助质粒pCI-NP和pCI-P经双酶切和测序鉴定到目的片段.pCI-NP、pCI-P转染后,RT-PCR检测到NP和P基因片段. 结论 新城疫病毒pCI-NP、pCI-P辅助质粒构建成功,pCI-NP、pCI-P可在BHK-21细胞中表达,为该病毒的反向遗传操作系统的建立奠定了基础.
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腺伴随病毒载体介导帕金森病基因治疗的实验研究
一、材料和方法1.腺伴随病毒(adeno-associatedvirus,AAV)载体的制备:酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)质粒[芳香族氨基酸脱羧酶(aromatic amino-acid decarboxlase,AADC)或三磷酸鸟苷环水解酶I(GTP cyclohydrolase I,GCH)质粒]是AAV基因组反向末端重复序列之间依次含巨细胞病毒早期响应启动因子、人类生长激素第1内含子、人源性TH(AADC或GCH)基因、SV40多聚腺苷信号的载体质粒.以磷酸钙沉积法共转染载体质粒、辅助质粒和腺病毒基因质粒于293细胞.3天后回收并以冻融法裂解细胞,经离心所获得上清再经过2次氯化铯(CsCl)梯度密度超离心等精制处理,终得到AAV-TH、AAV-AADC及AAV-GCH载体.以DNA斑点印迹法测定载体滴度为1 012～1 013颗粒/ml.
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腺伴随病毒载体介导帕金森病猴基因治疗的实验研究
我们在以往的研究基础上,进一步探讨多巴胺合成酶基因的三重共转导对帕金森病灵长类模型基因治疗实验结果.材料和方法:(1)腺伴随病毒(AAV)载体的制备:酪氨酸羟化酶(TH)质粒[芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)或三磷酸鸟苷环水解酶I(GCH)质粒]是AAV基因组反向末端重复序列之间依次含巨细胞病毒早期响应启动因子、人类生长激素第一内含子、人源性TH(AADC或GCH)基因、SV40多聚腺苷信号的载体质粒.以磷酸钙沉积法共转染载体质粒、辅助质粒和腺病毒基因质粒于293细胞.3 d后回收并以冻融法裂解细胞,经离心所获得上清再经过2次氯化铯(CsCl)梯度密度超离心等精制处理,终得到AAV-TH、AAV-AADC及AAV-GCH载体.
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新城疫病毒Italien株辅助质粒的构建及功能鉴定
目的 构建基于T7启动子的含新城疫病毒(NDV)Italien株核衣壳蛋白(NP)、磷酸化蛋白(P)和蛋白(L)基因的表达质粒,作为构建重组NDV所需的辅助质粒.方法 将NDV的NP、P和L基因酶切后置于T7启动子和核糖体进入位点序列的下游,分别构建NP、P和L基因的表达质粒,转染BSR-T7/5细胞,采用间接免疫荧光法(1FA)检测病毒蛋白的表达,利用微型基因组(MG-L)质粒检测辅助质粒组装核糖核酸蛋白质复合物(RNP)的功能.结果 测序证实辅助质粒构建正确.IFA检测可观察到NP和P基因的表达.与MG-L单转染对照组和空白对照组相比,辅助质粒和MG-L共转染后,报告基因萤火虫荧光素酶得到高效表达(P＜0.001).结论 成功构建了基于T7启动子的NDV辅助质粒,为进一步构建重组溶瘤NDV Italien株奠定了基础.
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抗体库技术中辅助噬菌体的研究进展
噬菌体抗体库作为噬菌体展示和抗体库2种技术的集合体,可以不需经过免疫而直接获取各种人源抗体,目前已广泛应用于生物学及医学等领域.在通常使用的噬菌粒系统中,使用野生型辅助噬菌体会导致"噬菌体污染",使得仅有很少部分子代噬菌体带有抗体片段,这对抗体库的筛选工作非常不利.近年来,研究人员通过对噬菌体衣壳蛋白基因(g3)部分缺失、引入琥珀突变、构建新型辅助噬菌体或辅助质粒等策略,不仅有效避免了辅助噬菌体污染问题,使抗体展示效率提高了5～20倍,进而通过增加单价抗体展示在每个噬菌体表面,使抗原结合能力提高400倍,并且在第二轮筛选中即可得到有效富集(阳性克隆率超过50%).本文综述了近年来应用在噬菌体抗体库的一些新型的辅助感染系统.
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副流感病毒5型CC-14株辅助质粒的构建及鉴定
目的 构建副流感病毒5型(parainfluenza virus 5,PIV5)CC-14株核衣壳蛋白(nucleoprotein,NP)、磷蛋白(phosphoprotein,P)和聚合酶蛋白(large protein,L)基因真核表达质粒,并在MDCK细胞中表达,为该病毒反向遗传系统的建立奠定基础.方法 根据PIV5 CC-14株全基因组中的NP、P和L基因分别设计特异性引物,经RT-PCR扩增得到NP、P和L基因,酶切后分别连接至pcDNA3.1+真核表达载体(或pMD18-T)上,构建辅助质粒pcDNA3.I-NP、pcDNA3.1-P和pcDNA3.I-L,转染MDCK细胞,RT-PCR检测NP、P和DL基因的转录情况.结果 经双酶切及测序鉴定证明辅助质粒pcDNA3.1-NP、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L构建正确,3个质粒转染MDCK细胞后,经RT-PCR分别可扩增得到NP、P和DL基因片段.结论 成功构建了PIV5 CC-14株pcDNA3.1-NP、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L辅助质粒,且均可在MDCK细胞中有效转录,为该病毒反向遗传系统的建立奠定了基础.
