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腺伴随病毒载体介导帕金森病基因治疗的实验研究
一、材料和方法1.腺伴随病毒(adeno-associatedvirus,AAV)载体的制备:酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)质粒[芳香族氨基酸脱羧酶(aromatic amino-acid decarboxlase,AADC)或三磷酸鸟苷环水解酶I(GTP cyclohydrolase I,GCH)质粒]是AAV基因组反向末端重复序列之间依次含巨细胞病毒早期响应启动因子、人类生长激素第1内含子、人源性TH(AADC或GCH)基因、SV40多聚腺苷信号的载体质粒.以磷酸钙沉积法共转染载体质粒、辅助质粒和腺病毒基因质粒于293细胞.3天后回收并以冻融法裂解细胞,经离心所获得上清再经过2次氯化铯(CsCl)梯度密度超离心等精制处理,终得到AAV-TH、AAV-AADC及AAV-GCH载体.以DNA斑点印迹法测定载体滴度为1 012~1 013颗粒/ml.
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重组BPI对内毒素休克大鼠肝脏一氧化氮合酶和微循环灌注的影响
体外试验显示,杀菌/通透性增加蛋白(BPI)能与多种革兰氏阴性菌脂多糖分子结合,并抑制脂多糖诱导的细胞应答反应.我们新近的观察证实,重组BPI片段(rBPI21)能有效减轻内毒素休克时全身血流动力学紊乱及组织微循环障碍,但其确切的作用机理尚不清楚.本研究应用大鼠内毒素攻击模型,旨在探讨rBPI21对内毒素诱导肝组织一氧化氮合酶(NOS)和局部微循环灌注的影响及其意义.大鼠腹腔注射大肠杆菌内毒素(15.0 mg/kg)复制内毒素休克模型,动物随机分为正常对照组(n=10)、内毒素休克组(简称休克组,n=20)和rBPI21治疗组(简称治疗组,n=20).治疗组动物于内毒素攻击后0.5、2小时静脉注射rBPI21(10.0mg/kg);休克组、治疗组动物分别于内毒素攻击后4、8小时活杀,留取肝组织标本检测NOS活性、三磷酸鸟苷环水解酶I(GTP-CHI)活性及生物喋呤含量,同时还观察肝脏微循环血流灌注量的改变.结果显示:(1)内毒素休克大鼠肝组织结构型NOS(cNOS)活性仅呈现升高趋势,但与对照组相比无明显差异(P>0.05),而诱生型NOS(iNOS)活性则大幅度上升,内毒素攻击后8小时为基础值的13.5倍(P<0.01).给予rBPI21治疗可有效抑制肝组织iNOS活性(P<0.01),但对cNOS活性无明显影响(P>0.05).(2)休克组肝脏微循环灌注量迅速下降,4、8小时分别为对照46.4%、35.3%(P<0.01);治疗组动物肝脏微循环障碍明显改善,内毒素攻击后4小时其灌注量显著高于休克组(P<0.01),8小时则趋于正常对照值.(3)治疗组局部组织GTP-CHI活性降低(P<0.01),生物喋呤含量亦显著下降(P<0.05).该结果表明:内毒素休克早期给予rBPI21能选择性抑制肝组织iNOS活性及改善局部微循环,其作用机理与降低组织GTP-CHI活性及其介导生物喋呤诱生有关.
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腺伴随病毒载体介导帕金森病猴基因治疗的实验研究
我们在以往的研究基础上,进一步探讨多巴胺合成酶基因的三重共转导对帕金森病灵长类模型基因治疗实验结果.材料和方法:(1)腺伴随病毒(AAV)载体的制备:酪氨酸羟化酶(TH)质粒[芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)或三磷酸鸟苷环水解酶I(GCH)质粒]是AAV基因组反向末端重复序列之间依次含巨细胞病毒早期响应启动因子、人类生长激素第一内含子、人源性TH(AADC或GCH)基因、SV40多聚腺苷信号的载体质粒.以磷酸钙沉积法共转染载体质粒、辅助质粒和腺病毒基因质粒于293细胞.3 d后回收并以冻融法裂解细胞,经离心所获得上清再经过2次氯化铯(CsCl)梯度密度超离心等精制处理,终得到AAV-TH、AAV-AADC及AAV-GCH载体.