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Jo-1抗原的提取和纯化
目的 改进从兔胸腺中纯化能用于斑点印迹法检测抗-Jo-1抗体、Jo-1抗原的方法.方法 用PBS提取兔胸腺匀浆中的ENA,经丙酮沉淀上清中的总蛋白制成兔胸腺丙酮粉,再经以特异性抗-Jo-1抗血清中的IgG为配体制备的亲和色谱柱对Jo-1抗原纯化,得到高比活的制品.结果 100 g兔胸腺可制得5~7 g丙酮粉,其中的蛋白质含量为19%~24%.经亲和色谱分离的洗脱峰组分约可富集Jo-1抗原1900倍,抗原活性回收率为2.5%,并只对抗-Jo-1抗血清有特异性反应.虽然在SDS-PAGE上洗脱峰组分并非单一条带,但免疫印迹只发现50 ku处有阳性条带.在含有MgCl2的水溶液中,高纯度的Jo-1抗原能长时间保持高活性.结论 亲和色谱法可从兔胸腺中纯化出满足斑点印迹法检测抗-Jo-1抗体要求的抗原,并有可能成为大量获取高纯度Jo-1抗原的方法.
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慢病毒-基质细胞衍生因子-1α-绿色荧光蛋白载体转染大鼠心肌成纤维细胞
目的 探讨慢病毒-基质细胞衍生因子-1α-绿色荧光蛋白(LV-SDF-1 α-GFP)对心肌成纤维细胞影响,佳感染条件及目的蛋白表达和分泌特点.方法 差速贴壁法分离培养乳大鼠心肌成纤维细胞,观察和免疫荧光鉴定.不同滴度及条件的LV-SDF-1 α-GFP转染心肌成纤维细胞,观察荧光表达,探索佳转染条件.LV-SDF-1α-GFP目的基因病毒以及阴性对照CON145病毒的转染心肌成纤维细胞,绘制生长曲线,探索转染对心肌成纤维细胞的增殖有无明显影响.利用佳转染剂量组转染心肌成纤维细胞,斑点印迹法(Dot blotting)检测SDF-1 α目的蛋白分泌.计量资料进行统计学分析.结果 心肌成纤维细胞具很高活性,传至4代纯度高,折光度好,无自发性搏动.LV-SDF-1 α-GFP佳转染感染复数(MOI)值为10,添加感染增强液,聚凝胺组感染效果好,效率达80%.LV-SDF-1 α-GFP组以及阴性对照CON145组对心肌成纤维细胞毒性作用小,细胞形态无明显变化,与非转染组生长曲线相似,差异无统计学意义(P>0.05).转染LV-SDF-1 α-GFP的心肌成纤维细胞培养至第4天SDF-1α蛋白分泌量达高值,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 LV-SDF-1 α-GFP载体对心肌成纤维细胞具很高的转染效率,细胞毒性小,并能够分泌SDF-1α目的蛋白.
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腺伴随病毒载体介导帕金森病基因治疗的实验研究
一、材料和方法1.腺伴随病毒(adeno-associatedvirus,AAV)载体的制备:酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)质粒[芳香族氨基酸脱羧酶(aromatic amino-acid decarboxlase,AADC)或三磷酸鸟苷环水解酶I(GTP cyclohydrolase I,GCH)质粒]是AAV基因组反向末端重复序列之间依次含巨细胞病毒早期响应启动因子、人类生长激素第1内含子、人源性TH(AADC或GCH)基因、SV40多聚腺苷信号的载体质粒.以磷酸钙沉积法共转染载体质粒、辅助质粒和腺病毒基因质粒于293细胞.3天后回收并以冻融法裂解细胞,经离心所获得上清再经过2次氯化铯(CsCl)梯度密度超离心等精制处理,终得到AAV-TH、AAV-AADC及AAV-GCH载体.以DNA斑点印迹法测定载体滴度为1 012~1 013颗粒/ml.
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第二代杂交捕获法检测子宫颈癌人乳头瘤状病毒影响因素的研究
全世界每年有45万子宫颈癌新发病例,我国估计为10万,约占1/4,并呈年轻化及上升趋势[1].子宫颈癌系女性生殖器常见的恶性肿瘤,在中国农村是一个主要的健康问题,山西省襄垣县、阳城县就是典型的高发现场.国际医学专家证实,99.7%的子宫颈癌由高危型人乳头瘤病毒(HPV)引起[2],国内HPV检测多采用斑点印迹法、原位杂交法、Southern杂交法和聚合酶链反应.中国医学科学院肿瘤研究所/肿瘤医院流行病室首家引入美国Digene公司提供的第二代杂交捕获法(hybrid capture Ⅱ,HC-2)进行HPV DNA检测,并建立检测实验室.本实验室承担了山西省襄垣县和阳城县子宫颈癌普查的所有标本的HPV DNA检测任务.现将实验结果及相关影响因素研究报告如下.
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反向斑点印迹法测定结核分枝杆菌基因组中IS6110插入位点
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黑色普氏菌对人血红蛋白的利用和结合
目的:观察黑色普氏菌能否利用人血红蛋白作为其铁源并与其结合.方法:将黑色普氏菌接种于含有各种浓度血红蛋白的TSB-联吡啶培养基中,厌氧培养,分光光度计监测细菌生长.采用斑点印迹法观察黑色普氏菌能否与人血红蛋白结合.结果:人血红蛋白能够浓度依赖性地促进黑色普氏菌的生长,黑色普氏菌能够与人血红蛋白结合,其结合强度受pH影响, pH=5时结合能力强.结论:黑色普氏菌能够有效地利用人血红蛋白作为其铁源并与其结合.
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黑色普氏菌与血红蛋白结合的特点及其血红蛋白结合蛋白的鉴定
目的:观察黑色普氏菌与血红蛋白结合的特点并鉴定血红蛋白结合蛋白.方法:采用斑点印迹法观察黑色普氏菌的血红蛋白结合特点,利用SDS-PAGE及Western blot法鉴定血红蛋白结合蛋白.结果: 热及胰蛋白酶预处理细菌使血红蛋白结合能力分别降低68%和35%,珠蛋白的抑制率为81%,乳铁蛋白部分抑制血红蛋白结合,转铁蛋白、细胞色素C和过氧化物酶对血红蛋白的结合皆无抑制作用.Western blot结果显示,相对分子量Mr为4.1×104,5.6×104和5.9×104的膜蛋白能与血红蛋白反应.结论:4.1×104,5.6×104和5.9×104的细胞膜蛋白可能参与了黑色普氏菌与血红蛋白的结合.
关键词: 黑色普氏菌 血红蛋白 斑点印迹法 SDS-PAGE Western blot