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腺伴随病毒载体介导帕金森病基因治疗的实验研究
一、材料和方法1.腺伴随病毒(adeno-associatedvirus,AAV)载体的制备:酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)质粒[芳香族氨基酸脱羧酶(aromatic amino-acid decarboxlase,AADC)或三磷酸鸟苷环水解酶I(GTP cyclohydrolase I,GCH)质粒]是AAV基因组反向末端重复序列之间依次含巨细胞病毒早期响应启动因子、人类生长激素第1内含子、人源性TH(AADC或GCH)基因、SV40多聚腺苷信号的载体质粒.以磷酸钙沉积法共转染载体质粒、辅助质粒和腺病毒基因质粒于293细胞.3天后回收并以冻融法裂解细胞,经离心所获得上清再经过2次氯化铯(CsCl)梯度密度超离心等精制处理,终得到AAV-TH、AAV-AADC及AAV-GCH载体.以DNA斑点印迹法测定载体滴度为1 012~1 013颗粒/ml.
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腺伴随病毒载体介导帕金森病猴基因治疗的实验研究
我们在以往的研究基础上,进一步探讨多巴胺合成酶基因的三重共转导对帕金森病灵长类模型基因治疗实验结果.材料和方法:(1)腺伴随病毒(AAV)载体的制备:酪氨酸羟化酶(TH)质粒[芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)或三磷酸鸟苷环水解酶I(GCH)质粒]是AAV基因组反向末端重复序列之间依次含巨细胞病毒早期响应启动因子、人类生长激素第一内含子、人源性TH(AADC或GCH)基因、SV40多聚腺苷信号的载体质粒.以磷酸钙沉积法共转染载体质粒、辅助质粒和腺病毒基因质粒于293细胞.3 d后回收并以冻融法裂解细胞,经离心所获得上清再经过2次氯化铯(CsCl)梯度密度超离心等精制处理,终得到AAV-TH、AAV-AADC及AAV-GCH载体.
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基因突变致β细胞KATP通道超敏感性可致新生鼠严重糖尿病
β细胞中葡萄糖升高致ATP/ADP比值升高,从而关闭K通道导致细胞去极化,Ca2+内流使胰岛素分泌而降低血糖。因而人们推测基因突变致β细胞中KATP通道对ATP/ADP升高的敏感性降低,继而胰岛素分泌不足而致糖尿病。 方法与设计构建突变KATP基因质粒重组子,分别为Kir 6.2亚单位N端2-30缺失(Kir 6.2[△N2-30])及Kir 6.2亚单位N端2-30缺失合并185点突变(Kir 6.2[△N2-30,K185Q])。将两种突变基因于C端与绿荧光蛋白(GTP)融合(以利于检测),使其与KATP磺脲类受体1亚单位DNA共同表达形成功能性KATP。将构建质粒注入C57B16*CBA鼠卵中,使其在胰岛素启动子1控制下于胰岛β细胞中表达。培养基因突变小鼠。 结果在60只新生鼠中未检测到1只携有Kir 6.2[△N2-30,K185Q]基因,而检测到5只携带Kir 6.2[△N2-30]基因。将这5只鼠与CD-1系鼠繁殖建立5种转基因鼠系。结果5种鼠系中有4系原代鼠均血糖正常且发育正常,而其所有F1代鼠均有严重高血糖、低胰岛素血症、血D-3-羟丁酸水平显著升高,且大多于5 d内死亡,或者体重显著降低而需胰岛素维持。另外1系F1代小鼠同样携带Kir 6.2[△N2-30]基因,但研究发现其胰岛中受累β细胞非常少,因而其血糖正常。同时,研究还发现所有小鼠胰岛的形态、胰岛素的定位,β细胞的分布均正常。 结论研究证实KATP通道的高敏感性,也即对ATP/ADP升高的反应性降低可以抑制胰岛素的分泌,导致严重糖尿病发生。
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安福隆治疗流行性腮腺炎42例疗效体会
安福隆系利用携带有人白细胞干扰素基因质粒的重组假单孢菌生产,具有广谱抗病毒、抑制细胞增殖以及提高免疫功能等作用.提高免疫功能包括增强巨噬细胞的吞噬作用,增强淋巴细胞对靶细胞的细胞毒性和天然杀伤细胞的功能.
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外源基因在在体周围神经的表达
我们应用浸泡过含外源基因质粒溶液的医用缝线,缝合兔坐骨神经,旨在探讨应用外源基因缝线法将外源基因直接转染入在体周围神经并得以表达的可行性,现报道如下.
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EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞中通过NFκB促进Igκ表达
利用已建立的受四环素调控LMP1表达的鼻咽癌细胞系,用受CMV启动子调控的NFκB报道基因质粒pNFκB-luc的荧光素酶表达分析NFκB的活性,并以核蛋白的Western印迹方法观察LMP1表达前后核内NFκB组分p65量的改变,用全蛋白Western印迹分析Igκ蛋白质的表达等方法,探讨在鼻咽癌中,EB病毒LMP1蛋白是否通过核转录因子NFκB促进免疫球蛋白κ轻链(Igκ)基因的表达.结果显示在诱导LMP1表达的状态下,NFκB活性增强,NFκB的p65蛋白呈核内聚集现象,Igκ的表达增高,而导入反义LMP1表达质粒后,NFκB活性下降,Igκ的表达减弱;加入硫代磷酸化的反义NFκB p65或p50后,Igκ表达水平下降.因此,在鼻咽癌细胞中,NFκB作为LMP1信号转导通路上的枢纽,可能介导了LMP1对Igκ的表达调控.