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人C组轮状病毒VP8*蛋白与组织血型抗原的结合特征
目的 研究人C组轮状病毒SZ272 VP8*蛋白与组织血型抗原的结合特征.方法 利用原核表达系统表达并纯化人C组轮状病毒SZ272的VP8*蛋白,通过唾液结合实验分析SZ272 GST-VP8*融合蛋白与A、AB、B、O和O-(非分泌)型唾液的相互作用;通过寡糖结合实验分析SZ272 GST-VP8*融合蛋白与不同的组织血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)寡糖的结合情况.结果 电泳结果显示,有GST-VP8*融合蛋白目的条带,约为52×103 Da,与预期大小相符.唾液结合实验显示,SZ272 GST-VP8*融合蛋白与A和AB型唾液结合,而与B、O及非分泌(O-)型唾液不结合;寡糖结合实验显示,SZ272 GST-VP8*融合蛋白特异性地与A型HBGAs相结合.结论 A型组织血型抗原可能是人C组轮状病毒的潜在受体,为进一步研究C组轮状病毒的感染机制提供了基础和依据.
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丙肝病毒NS5B-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及稳定转染HepG2细胞系的建立
目的构建可表达丙型肝炎病毒(HCV)NS5B-EGFP融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的HepG2细胞系.方法利用PCR技术从HCV基因组中扩增出ns5b基因片段,XhoI/Kpn I双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP-N3真核表达载体,转化TG1菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒pEGFPN3-ns5b.将阳性克隆用脂质体法转染HepG2细胞,经持续G418压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系.结果成功构建了真核表达载体pEGFPN3-ns5b;建立了其重组质粒稳定转染的HepG2细胞系.结论重组质粒稳定转染的HepG2细胞系可表达NS5B-EGFP融合蛋白;该HepG2细胞系可以应用于以ns5b基因为靶位的抗HCV感染研究.
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登革病毒1～4型E蛋白结构域Ⅲ融合蛋白的表达纯化及功能研究
目的 了解原核表达的登革病毒(Dengue virus,DV)1～4型融合的E蛋白结构域Ⅲ直接抑制登革病毒感染及其抗体的中和作用.方法 通过连接肽将1～4型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区串联的基因产物插入PET30a在大肠埃希菌中进行表达、纯化后,应用Western Blot及间接ELISA验证表达产物.将融合蛋白免疫新西兰大白兔制备免疫血清,应用间接免疫荧光检测多抗血清的活性.将融合蛋白及多抗血清分别进行阻断实验和中和实验,对抗原及抗体的功能进行研究.结果 在大肠埃希菌中成功表达了串联的登革病毒1～4型E蛋白结构域Ⅲ融合蛋白,并得到兔抗免疫血清,分别对融合蛋白及兔抗免疫血清进行验证.融合蛋白能够阻断1～4型DV感染,兔抗免疫血清能中和1～4型DV,但中和抗体效价不同.结论 串联表达的登革病毒包膜蛋白Ⅲ区可抑制登革病毒感染,串联rEⅢ蛋白免疫新西兰大白兔产生的针对DV1～4型包膜蛋白结构域Ⅲ区的抗体对登革病毒具有中和作用.
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丙型肝炎病毒亚单位融合蛋白的表达及免疫原性测定
目的 获得高纯度的丙型肝炎亚单位融合蛋白并评价其免疫原性.方法 利用原核表达系统,以pET-11d作为载体,在大肠埃希菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达获得融合蛋白,之后采用DEAE阴离子交换和镍离子柱亲和层析进行纯化.通过Western Blot验证融合蛋白的抗原活性.同时以该蛋白免疫实验动物后测定血清中的抗体滴度.结果 成功获得很高纯度的丙型肝炎哑单位融合蛋白,EIA显示融合蛋白能够诱生出高滴度的抗体.结论 原核表达系统表达的丙型肝炎病毒亚单位融合蛋白具有较强的免疫原性,为丙型肝炎病毒治疗性和预防性疫苗的研制提供了一条新的途径.
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TAT-HBX-EGFP融合蛋白的表达、纯化及在小鼠肝脏内的跨膜分布
目的 高效表达TAT-HBX-EGFP融合蛋白,研究其在小鼠肝脏内的分布.方法 构建TAT-HBX-EGFP重组载体,IPTG诱导使其在BL21中大量表达;蛋白经Ni柱纯化后注射入小鼠体内,免疫荧光观察TAT-HBX-EGFP融合蛋白在小鼠肝脏的分布.结果 TAT-HBX-EGFP在大肠埃希菌中获得高效表达;HBX蛋白可以在TAT的引导下进入小鼠肝脏.结论 TAT引导肽可以将HBX蛋白引导至小鼠肝脏.
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原核表达的PD-1与PD-L1融合蛋白相互作用分析
目的 分析经原核表达纯化的PD-1和PD-L1融合蛋白分子间相互作用力及其生物学活性.方法 PD-1蛋白经过预浓缩后,用氨耦联的原理固定于CM5芯片表面,用HBS-EP缓冲液梯度稀释PD-L1蛋白,以20μl/min流速注射到耦联PD-1的传感芯片通道上,结合3 min,解离15 min;观察两者结合情况并用BIA Evaluation软件4进行分析.结果 PD-1在缓冲液的pH值为4.5、浓度为40μg/ml的状态下能稳定耦联于CM5芯片表面,RU值约为3300;稀释度为200 mmol/ml的PD-L1与PD-1能较好地结合,RU值为150,亲和常数为K_D=3.5×10~(-6).结论 经原核表达纯化的PD-1与PD-L1融合蛋白具有较强的特异性亲和力及良好的生物学活性,为下一步研究的开展打下基础.
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甲型流感病毒NP和M2e融合蛋白高效表达和纯化
目的 探索甲型流感病毒NP-M2e融合蛋白在大肠埃希菌中可溶性高效表达和纯化的条件.方法 将NP-M2e融合基因(NM2e)经密码子优化后插入pET30a后获得pET30a-NM2e原核表达质粒,通过转化BL21(DE3)后的克隆筛选、诱导温度与诱导时间等条件的优化实现NM2e蛋白在大肠埃希菌中的可溶性高效表达;表达产物经离子交换层析与分子筛层析纯化并通过Western-Blot鉴定其抗原性.结果 NM2e基因正确插入pET30a中并能在大肠埃希菌中表达;25℃温度诱导下NM2e蛋白出现可溶性表达,诱导时间由4h延长至10 h可明显提高蛋白表达量;可溶性NM2e蛋白经阴离子交换和凝胶过滤层析两步纯化后的纯度可达90％,纯化产物能特异性结合NP鼠多抗及M2e鼠单抗.结论 甲型流感病毒NM2e融合蛋白能在大肠埃希菌中高效表达和纯化并保持良好的免疫反应活性.
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呼吸道合胞病毒F蛋白第168～289氨基酸片段的昆虫细胞表达及其抗原性分析
目的 研究人呼吸道合胞病毒(RSV)F基因第546～881碱基编码的融合蛋白(即F蛋白)主要抗原性区域第168～289氨基酸片段的抗原性初步探讨其作为诊断抗原的应用价值.方法 用逆转录(RT)-PCR的方法扩增出RSV Long株F基因546～881 bp片段(F'),将其插入到转移载体质粒pBacPAK9中,获得相应的重组质粒pBacRSV F',与线性杆状病毒BacPAK6 DNA(Bsu36 Ⅰ酶切)共转染Sf9昆虫细胞获得重组病毒BacPAK F',并在昆虫细胞中表达.重组蛋白用Ni2+螫合柱亲和层析纯化,用免疫印迹(Western blot,WB)法检测重组蛋白的抗原活性.并用该方法检测33例急性下呼吸道感染患儿血清特异性抗体,同时用间接免疫荧光法检测患儿的鼻咽分泌物中RSV抗原.对两种方法检测标本的阴性率进行比较.结果 重组病毒BacPAK F'在昆虫细胞中表达相对分子质量约13 000的重组蛋白.纯化后的重组蛋白能与特异性抗RSV抗体结合.WB检测33例急性下呼吸道患儿血清特异性抗体,结果显示阳性11例,阳性率为33.3%,免疫荧光法检测结果阳性9例,阳性率为27.3%,2种检测方法阳性率差异无统计学意义(x2=0.29,P>0.05).结论 纯化后的在昆虫细胞中表达的RSV F基因546～881 bp片段编码的融合蛋白片段具有较强的抗原活性,对RSV感染的快速诊断具有一定的临床应用价值.
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腺病毒载体介导的ICOSIg融合基因对实验性自身免疫性心肌炎作用的研究
目的 探讨腺病毒载体介导的ICOSIg基因治疗对实验性自身免疫性心肌炎(EAM)的作用.方法 将人ICOS胞外域与免疫球蛋白IgGFc段融合,构建ICOSIg融合基因的腺病毒表达载体p-Adeno-ICOSIg.PacⅠ消化腺病毒载体后转染HEK 293细胞,生产表达ICOSIg融合蛋白的腺病毒;构建增强型绿色荧光蛋白腺病毒作为对照.皮下注射猪心肌肌球蛋白诱导Lewis大鼠EAM模型,随机分为4组,分别于免疫当天(第0天)(A组,n=15)和第14天(B组,n=15)通过股静脉注射ICOSIg重组腺病毒,观察共刺激分子融合蛋白对T细胞激活阶段和炎症阶段的作用,C组(n=10)和D组(n=10)分别在第0天和第14天注射表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组腺病毒.另设E组(n=10)未接受免疫的正常对照组.免疫第28天,超声心动图检测后处死动物.HE染色检测心肌炎症浸润程度.Western blot检测心肌ICOS、ICOSL、B7-1及B7-2蛋白表达.实时定量RT-PCR定量心肌IL-2、IL-4和IFN-γ mRNA水平.结果 第28天B组大鼠心功能指标(短轴缩短率:40.6±6.2 比 26.2±4.6, 20.8±5.6, 21.7±9.6)、心肌炎症程度较对照组显著改善.Western blot显示B组ICOS、ICOSL及B7-1蛋白表达显著下调,各组间B7-2蛋白表达差异未见统计学意义.B组大鼠心肌组织IFN-γ mRNA表达降低(19.8±7.9比 66.6±4.5, 79.6±5.9, 80.9±5.1),IL-4 mRNA表达增加(42.3±8.6 比 19.7±3.8, 22.3±9.0, 28.3±2.2),IL-2表达各组间无显著差异,因此B组IFN-γ/IL-4比值显著低于A、C及D组(0.47±0.36 比2.91±0.22, 1.89±0.42, 2.32±0.83),表明Th细胞因子平衡向Th2方向偏离.结论 炎症高峰期以ICOSIg阻断共刺激分子通路能够减轻EAM心肌组织炎症,改善大鼠心脏功能.其机制可能是下调心肌组织局部ICOS、ICOSL和B7-1表达及对炎症性细胞因子的抑制作用.
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以病毒样颗粒为载体的小肾母细胞瘤新型疫苗的研制
目的 对小儿肾母细胞瘤以病毒样颗粒为载体的新型疫苗进行初步研究,为该肿瘤的治疗以及替代手术后放疗和化疗提供新的切入点.方法 采用基因重组技术分别克隆编码小儿肾母细胞瘤WT1表位肽HLA-A*2402、HLA-A*-2402x,将其融合到乙型肝炎核蛋白基因片段上,运用棒状杆菌表达系统对融合蛋白进行表达. 结果细胞病变显示病毒重组,SDS-PAGE显示目的 蛋白的表达,电镜下可观察到目的 蛋白.结论 小儿肾母细胞瘤WT1表位肽HLA-A*2402、HLA-A*2402x融合到乙型肝炎核蛋白基因片段上可以产生融合病毒样颗粒,该融合蛋白的制备将为小儿肾母细胞瘤的免疫治疗提供新的思路.
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丙型肝炎病毒F蛋白克隆表达及其抗原性
目的 在原核表达系统中诱导表达1b型HCV F蛋白及Core蛋白,建立F抗体ELISA检测方法,对F蛋白在慢性丙型肝炎患者体内的抗原性作相关研究.方法 应用RT-PCR方法从HCV感染者血清中获得Core蛋白编码基因,在第42位和144位人工增加或减少1个核苷酸,使其读码框移位,利用多重PCR技术拼接获得全长F蛋白的基因序列,分别构建编码F和Core蛋白的重组质粒.将鉴定正确的重组质粒转人大肠埃希菌BL21中,加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达HCV Core和F蛋白.应用镍离子亲和层析树脂纯化蛋白,并用Western印迹法鉴定其免疫原性.建立ELISA检测方法对121例慢性丙型肝炎患者血清巾抗F蛋白抗体进行检测.结果 成功构建含HCV F蛋白、Core蛋白编码基因的重组克隆,表达纯化获得的HCV F蛋白和Core蛋白,Western印迹法鉴定并确定其特异性.121例慢性丙型肝炎患者血清巾抗Core和抗F抗体的阳性率分别是93%和65%,而40例HBV感染者和40例健康对照者血清反应阴性.结论 F蛋白在HCV自然感染中有表达,并能产生特异的免疫反应,其生物学功能及在HCV感染过程中的作用有待进一步研究.
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HIV-1 GP41第二优势表位簇在大肠杆菌中的高效表达
①目的构建HIV-1 SF2株跨膜蛋白GP41第二优势表位簇基因的原核高效表达克隆,探讨提高原核表达的途径.②方法根据密码子的兼并性,利用PCR-定点突变技术扩增、改造目的基因片段,将其与原核表达载体pGEX4T-2经EcoRI和SalI双酶切、连接,重组质粒pGEX4T-2/SE转化表达宿主菌DH5α,经IPTG诱导表达出目的融合蛋白,经SDS-PAGE与Western-Blot鉴定.③结果获得了高效表达HIV-1 GP41第二优势表位谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白的重组菌;Western-Blot鉴定表明,重组蛋白具有良好的抗原性和特异性.④结论在原核表达体系中可以高效表达HIV-1 GP41第二优势表位簇.
关键词： HIV包膜蛋白质gp41 基因表达 免疫优势表位 病毒融合蛋白质类
