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结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达
目的在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6和CFP-10,获得纯化的重组ESAT6-CFP10(rCFP10-ESAT6)融合蛋白抗原.方法通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction ,PCR)扩增CFP10-ESAT6融合基因;以质粒pET-28a为表达载体,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3);以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,通过SDS-PAGE电泳和蛋白免疫印迹法 (Western blotting) 鉴定rCFP10-ESAT6在大肠杆菌中的表达,确定rCFP10-ESAT6蛋白抗原在大肠杆菌中的表达形式;采用Chelating Sepharose Fast Flow蛋白纯化试剂纯化重组蛋白.Western blotting及酶联免疫吸附试验(ELISA)分析重组蛋白的免疫原性.结果重组质粒pET28a-CFP10-ESAT6中目的基因测序结果与报道序列相同;在大肠杆菌中以可溶性形式表达;分子量约28kDa,表达量约占菌体总蛋白的46%,纯化后的rCFP10-ESAT6样品经SDS-PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为90%左右,每100 ml培养菌可获得16 mg左右的重组蛋白;Western印迹结果证实重组蛋白与His·tag单克隆抗体及确诊的肺结核病患者血清发生特异免疫反应.ELISA结果分析表明,该重组抗原能区分肺结核患者血清及正常人血清.结论成功地表达和纯化了结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白,该重组蛋白具有特异的免疫原性.
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以ESAT-6、CFP-10为基础的ELISPOT试验、血清TB-SA抗体检测、PPD试验在肺结核诊断中应用价值研究
免疫学技术是结核分枝杆菌感染的重要诊断方法.血清结核抗体的检测已作为结核病诊断辅助指标之一[1],TB-SA(tuberculosis-specific antigen)抗体检测在肺结核诊断中具有较高的敏感性和特异性[2];PPD皮肤试验已被卫生部生物制品标化委员会规定可临床诊断的参考指标嘲;近年来以结核菌特异蛋白ESAT-6(6 KD early secretory antigenic target)、CFP-10(culture filtrate protein 10)为基础的酶联免疫斑点试验(ELISPOT TEST)在结核感染诊断中的应用价值已被许多相关研究所证实[4-6],本研究旨在评价3种试验在肺结核诊断中的应用价值.
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ELISPOT检测技术在儿童结核病诊断中的应用
为了评价ELISPOT试验在儿童结核病诊断中的应用价值,采用以结核分枝杆菌特异性蛋白ESAT-6和CFP-10(culture filtrate protein-10)为抗原的ELISPOT试验技术,检测了42例非结核性肺疾病患儿和27例活动性结核病患儿体内特异性T淋巴细胞分泌的γ-干扰素水平,评价其在儿童活动性结核病和潜伏结核感染中的敏感性和特异性,并将结果与结核菌素皮试结果(PPD)进行比较;同时分析了该试验的各影响因素.结果显示,ELISPOT试验的敏感性为88.9%,特异性(97.6%)高于PPD(81%,P﹤0.05);与PPD试验结果结合分析,其诊断阳性率为96.3%.此外,ELISPOT试验结果与性别、年龄、BCG接种史、结核病接触史、机体免疫状态、PPD直径和感染部位等影响因素之间的相关性进行了初步探讨.实验结果提示ELISPOT试验适宜作为儿童PPD试验初筛后结核病诊断的重要辅助工具.
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筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的研究
目的 建立SELEX技术筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的方法,并获得CFP-10 的高亲和性适体.方法 体外构建长度为78个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库,以微孔板为筛选介质,采用SELEX 技术筛选获得CFP-10的适体库.将适体库克隆、测序,用DNAMAN软件对其结构进行分析,利用酶联寡核苷酸吸附试验(enzyme-linked oligonucleotide sorbent assay,ELOSA)测定亲和力.结果 构建的ssDNA文库经过14轮筛选与CFP-10亲和力从0.273提高到1.265;克隆子测序,大多数长度与预期值相符.二级结构显示,口袋和茎环结构可能是适体与CFP-10结合的结构基础.结论 成功建立了SELEX筛选技术,并初步获得了CFP-10的高亲和性适体.
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结核杆菌CFP-10/ESAT-6融合基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其抗原性的初步研究
目的 构建表达结核分枝杆菌CFP-10/ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,并观察其对巨噬细胞的作用.方法 采用SOE法构建CFP-10/ESAT-6融合基因,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261中,将重组质粒电转化耻垢分枝杆菌,SDS-PAGE检测CFP-10/ESAT-6融合蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达.以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞一氧化氮合成酶的表达水平.结果 经DNA测序证实CFP-10/ESAT-6融合基因序列正确.重组耻垢分枝杆菌经热诱导后可以表达相对分子质量(Mr)约为18×103的融合蛋白,与预期值一致.重组耻垢分枝杆菌能够诱导小鼠巨噬细胞表达一氧化氮合成酶.结论 表达CFP-10/ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌构建成功,该重组耻垢分枝杆菌能够活化巨噬细胞,具有抗原性,为研制结核疫苗提供一定参考.
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含结核分枝杆菌ESAT6和CFP10基因的重组腺病毒表达载体的构建
目的 克隆结核分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,构建能同时表达两基因的重组腺病毒活载体,为研制能有效防治结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础.方法 首先利用PCR技术克隆结核分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,将两者通过IRES串连插入腺病毒转移载体中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10.该穿梭质粒转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,经间源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAdeasy-1-pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10.PacI酶切线性化该质粒,转染AD293细胞进行病毒包装.结果 ESAT-6和CFP-10基因成功克隆,其序列与GenBank公布的一致.两者通过IRES串连插入腺病毒转移载体,获得的重组穿梭质粒经同源重组,成功获得复制缺陷型重组腺病毒质粒Adeasy-1-pShuttle-CMV.ESAT-6-IRES-CFP-10,转染该质粒的AD293细胞出现细胞病变效应.结论 成功克隆了分枝杆菌的ESAT6和CFP-10基因,构建了含IRES串连的ESAT-6和CFP-10基因的重组腺病毒,为重组病毒活载体疫苗的研制奠定了基础.
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γ-干扰素释放实验在结核病诊断中的临床应用
目的:探讨γ-干扰素释放实验在结核病诊断中的使用效能及A(ESAT 6)、B(CFP-10)两种抗原的差异分析.方法:选取2015年6月~2016年2月住院并明确诊断的患者476例为研究对象,通过结核感染T细胞斑点实验(T-SPOT.TB)检测患者外周血中结核致敏T细胞数量,分析该技术在结核病中的诊断效能,并比较A、B两种抗原的一致性.结果:T-SPOT.TB检测阳性率为47.1%(224/476例)、阴性率为52.9%(252/476)、灵敏度为78.1%、特异度为80.6%、阳性预测值为78.1%、阴性预测值为80.6%、阳性似然比为4.02、阴性似然比为0.27.T-SPOT.TB两种抗原A和B对不同患者的诊断无统计学差异(各组P值均>0.05);总诊断效能一致性较好(Kappa>0.75).结论:T-SPOT.TB检测对于结核病的诊断具有较高的灵敏度和特异度,且A、B两种抗原表现出不同的阳性检出规律和意义.T-SPOT.TB检测在结核分枝杆菌(MTB)感染的筛查、结核病快速早期辅助诊断和排除感染方面具有重要作用.
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复合抗原 ESAT-6／CFP-10／Rv0315在活动性肺结核辅助诊断中的价值
目的：评价结核分枝杆菌复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315在活动性肺结核诊断中的应用价值。方法：选取初治肺结核病患者70例和健康体检者34例作为结核组和健康对照组，分离PBMCs，分别用复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库作为抗原进行ELISPOT实验，检测斑点形成细胞数。结果：复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库检测结核分枝杆菌感染的阳性率依次为85．7％（60/70）、77．1％（54/70）、72．9％（51/70），特异性依次为82．4％（28/34）、85．3％（29/34）、88．2％（30/34）。结论：复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315作为抗原建立的ELISPOT 检测方法在活动性肺结核的辅助诊断中有较高的应用价值。
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复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615 c ELISPOT辅助诊断活动性肺结核的应用价值
目的:评估结核分枝杆菌复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615 c在活动性肺结核诊断中的应用价值.方法:选取肺结核病患者78例,非结核性肺部疾病患者27例和健康体检者39例,分别用复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库作为抗原刺激单个核淋巴细胞(PBMCs),采用酶联免疫斑点试验检测斑点形成细胞数,判断肺结核感染情况.结果:复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615 c、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库检测结核分枝杆菌感染的敏感性依次为87.2%(68/78)、80.8%(63/78)、76.9%(60/78),特异性依次为81.8%(54/66)、84.8%(56/66)、87.9%(58/66).结论:复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c有较高的敏感性和特异性,对活动性肺结核的辅助诊断有一定的临床应用价值.
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ESAT-6和CFP-10在感染性脊椎炎鉴别诊断中的作用
目的 探讨结核感染T细胞试验(T-SPOT.TB)中两种抗原6 kD早期分泌靶向抗原(ESAT-6)及10 kD培养滤过蛋白(CFP-10)在感染性脊椎炎鉴别诊断中的价值.方法 回顾性分析2014年7月到2017年7月就诊于我院,完成T-SPOT.TB及相关检查,终均通过血培养、病理组织学和脓液培养等手段明确病原学诊断的患者共59例(结核性脊椎炎38例、布鲁氏菌性脊椎炎11例和化脓性脊椎炎10例).绘制ROC曲线并分析ESAT-6、CFP-10在不同类型感染性脊椎炎中的作用;应用kappa一致性分析检验ESAT-6、CFP10在结核性脊椎炎患者中诊断的一致性.结果 ESAT-6敏感度为84.2％、特异度为90.5％;CFP-10敏感度为76.3％、特异度为100％.两种斑点计数结果具有较高的一致性(kappa=0.660,P<0.05),但ESAT-6与病原学诊断结果一致性更高.结论 ESAT-6具有较高的可信度可运用于感染性脊椎炎的鉴别诊断.
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结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白间的相互作用
目的观察结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白间的相互作用.方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌 ESAT-6与CFP-10 基因,构建酵母双杂交载体质粒pGBKT7-ESAT-6和pGADT7-CFP-10,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,采用醋酸锂法顺序转染酵母菌AH109.结果共转染pGBKT7-ESAT-6和pGADT7-CFP-10的酵母菌AH109可以在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基上生长,β-半乳糖苷酶活性实验阳性.结论结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白可以相互作用.
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结核分枝杆菌CFP-10单克隆抗体的研制与初步鉴定
目的:制备抗结核分枝杆菌CFP-10蛋白的单克隆抗体(mAb).方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术,以重组菌BL21(DE3)-pET-30a(+)-lhp原核表达的融合蛋白His-CFP-10作为抗原免疫BALB/c小鼠,以纯化的融合蛋白GST-CFP-10作为检测抗原,制备抗结核分枝杆菌CFP-10 mAb;采用间接ELISA、Dot-ELISA和Western blot鉴定mAb的特异性.结果:获得2株稳定分泌抗结核分枝杆菌CFP-10 mAb的杂交瘤细胞株6E8、2E7,其Ig亚类分别为IgG1、IgG2b.mAb 6E8、2E7腹水的ELISA效价分别为1:1 000 000,1:1 024 000.在Dot-ELISA试验中,这2株mAb均只与表达His-CFP-10及GST-CFP-10的重组大肠杆菌反应,与其他5种菌株均不发生反应.在Western blot试验中,2株mAb只与CFP-10蛋白发生反应,出现特异性条带.结果表明,mAb 6E8、2E7是针对结核分枝杆菌CFP-10的特异性mAb.结论:成功地制备抗结核分枝杆菌CFP-10的mAb,它们在结核分枝杆菌诊断和致病机理研究等方面有重要应用价值.
