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结核分枝杆菌Rv0901基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其细胞作用
目的 对结核分枝杆菌Rv0901基因的功能进行研究.方法 以PCR扩增Rv0901基因编码序列,定向克隆入穿梭表达质粒pMV261获得重组穿梭表达质粒,将重组质粒电穿孔进入耻垢分枝杆菌,构建重组Rv0901基因的耻垢分枝杆菌,对重组耻垢分枝杆菌进行诱导表达,用SDS-PAGE检测表达结果.比较耻垢分枝杆菌和重组耻垢分枝杆菌对THP-1细胞的不同作用.结果 成功构建重组穿梭表达质粒及重组Rv0901基因的耻垢分枝杆菌,重组菌诱导THP-1细胞的凋亡率高于耻垢分枝杆菌,其感染THP-1细胞后细胞的存活率低于耻垢分枝杆菌的感染,重组菌感染THP-1细胞后细胞培养液中NO(一氧化氮)的产生高于耻垢分枝杆菌的感染.结论 Rv0901基因可能与结核毒力存在一定关系.
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结核杆菌CFP-10/ESAT-6融合基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其抗原性的初步研究
目的 构建表达结核分枝杆菌CFP-10/ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,并观察其对巨噬细胞的作用.方法 采用SOE法构建CFP-10/ESAT-6融合基因,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261中,将重组质粒电转化耻垢分枝杆菌,SDS-PAGE检测CFP-10/ESAT-6融合蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达.以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞一氧化氮合成酶的表达水平.结果 经DNA测序证实CFP-10/ESAT-6融合基因序列正确.重组耻垢分枝杆菌经热诱导后可以表达相对分子质量(Mr)约为18×103的融合蛋白,与预期值一致.重组耻垢分枝杆菌能够诱导小鼠巨噬细胞表达一氧化氮合成酶.结论 表达CFP-10/ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌构建成功,该重组耻垢分枝杆菌能够活化巨噬细胞,具有抗原性,为研制结核疫苗提供一定参考.
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髓样分化因子88抑制剂ST2825影响重组耻垢分枝杆菌感染的THP-1细胞炎性分泌功能
目的 通过观察髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,myd88)抑制剂ST2825对重组耻垢分枝杆菌感染的THP-1细胞的炎性分泌功能的抑制,来探讨髓样分化因子88在分枝杆菌促巨噬细胞分泌炎性因子功能中的作用.方法 使用Myd88的抑制剂ST2825干预重组耻垢杆菌感染的THP-1细胞为实验模型,分为三组:实验组(THP-1细胞+重组耻垢分枝杆菌+ST2825)、对照组(THP-1细胞+重组耻垢分枝杆菌)、空白组(THP-1细胞),用ELISA法检测三组TNF-α、IL-12和IL-6的分泌情况.结果 实验组的TNF-α、IL-12和IL-6的量较对照组显著减少,其两者P值＜0.05,差异具有统计学意义.结论 髓样分化因子88抑制剂ST2825可抑制THP-1细胞的炎性分泌功能.
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流式细胞术检测胞内重组耻垢分枝杆菌的活力研究
目的 建立一种快速检测胞内分枝杆菌活力的方法 .方法 将一定量培养至对数生长期的含pMVeis的重组耻垢分枝杆菌感染U937巨噬细胞,以含空质粒的耻垢分枝杆菌为对照,吞噬作用2h后洗去胞外细菌,再分别培养4、12、24和48 h后收集细胞并裂解之.获得的胞内细菌用FDA荧光染料染色后用流式细胞仪检测死亡率,并与平板菌落计数法进行比较.结果 流式细胞仪检测出感染12 h后重组耻垢分枝杆菌胞内死亡率较对照组均有显著下降(P＜0.05),流式细胞仪检测法与平板菌落计数法相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 流式细胞术与传统的平板计数法相比具有快速、敏感、方便的特点,可用于分枝杆菌活菌快速检测.
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髓样分化因子88抑制剂ST2825对重组耻垢分枝杆菌感染THP-1细胞自噬的影响
目的：探讨髓样分化因子88抑制剂ST2825对重组耻垢分枝杆菌感染THP?1细胞自噬的影响。方法使用髓样分化因子88抑制剂ST2825作用于重组耻垢分枝杆菌感染的THP?1细胞，确定ST2825干预的实验组、无ST2825作用的对照组以及空白组。运用荧光显微镜观察自噬小体，RT?PCR检测Beclin?1基因和Bcl?2基因的mRNA的表达。结果与对照组比较，实验组的自噬荧光小点数目明显减少，差异具有统计学意义（P<0.05）；RT?PCR检测结果显示Beclin?1和Bcl?2 mRNA表达较对照组下调。结论髓样分化因子88抑制剂ST2858可能通过干扰Beclin?1和Bcl?2的分离，抑制THP?1细胞自噬。
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重组耻垢分枝杆菌NY-ESO-1疫苗的制备及其免疫原性分析
目的 制备重组耻垢分枝杆菌(recombinant Mycobacterium smegmatis,rM.smegmatis)NY-ESO-1疫苗,并分析其在小鼠体内的免疫原性.方法 从人睾丸mRNA中扩增NY-ESO-1基因,克隆至携带β半乳糖苷酶信号肽的表达载体,转化M.smegmatis,构建rM.smegmatis.以rM.smegmatis经腹腔免疫小鼠,200μl/只,于第12周用NY-ESO-1加强免疫1次,第3、6、9、12、13周经尾静脉采血1次,分离血清,并于第13周取小鼠脾脏,制备脾淋巴细胞,检测小鼠血清中NY-ESO-1抗体及其亚型、CD4+、CD8+T细胞比例、脾细胞增殖能力、IFNγ及IL-2的分泌水平及体外CTL杀伤能力.结果 加强免疫后,与NY-ESO-1组比较,rM.smegmatis-pLA71NY组小鼠血清抗体水平差异无统计学意义(P＞0.05),CD4+及CD8+T细胞比例、IFNγ及IL-2的分泌水平及体外CTL杀伤能力均显著升高(P＜0.05),脾细胞的增殖能力显著下降(P＜0.05).结论 rM.smegmatis NY-ESO-1疫苗在小鼠体内具有良好的免疫原性,为该疫苗用于肿瘤的免疫治疗奠定了基础.
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表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究
目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究.方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV-ESAT6,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌mc2155中.以SDS-PAGE检测ESAT-6蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达.以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平,裂解巨噬细胞,计数胞内存活细菌数.结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,经热诱导后可以表达相对分子质量约为6000的蛋白,与预期值一致.重组耻垢分枝杆菌能够诱导ANA-1细胞活化表达iNOS,并增强巨噬细胞的杀伤活性,重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组(P＜0.05).结论表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性,为构建新型结核疫苗提供了实验基础.
关键词： ESAT-6 大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒 重组耻垢分枝杆菌 巨噬细胞 -
重组耻垢分枝杆菌对小鼠结核病免疫治疗效果的评价
目的 评估携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染的治疗效果,及其与临床抗痨药物疗效的比较.方法 结核分枝杆菌H37Rv感染Balb/c小鼠4周后分别用生理盐水、GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌(重组M.S)、INH+PZA和重组M.S+INH+PZA治疗,于第1次治疗后3个月,处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和INF-α的分泌水平、血清IL-12和IFN-γ分泌水平、肺泡灌洗液SIgA的水平和肺、脾组织中GLS表达,同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况.结果 重组M.s、INH+PZA和重组M.s+INH+PZA治疗组肺、脾组织荷菌量(log CFU/g)比生理盐水组显著降低.重组M.s组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于其它组.重组M.s组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于其它组.各组产生黏膜特异性SIgA明显高于未经感染组.用免疫组化检测到小鼠肺及脾组织中GKS的表达.生理盐水组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛,正常肺泡结构被破坏;其余组肺组织病变轻且局限.结论 重组M.s对小鼠结核病有一定免疫治疗作用,通过增强宿主Th1型免疫应答和GLS的抗菌活性有关;重组M.S对临床常用的抗结核药有协同作用,为结核病的综合治疗打下实验基础.
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结核杆菌CRISPR-associated Csm4(Rv2820c)诱导iNOS表达对耻垢杆菌胞内存活的影响
目的 研究Csm4蛋白在重组耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,MS)中的表达及其影响胞内存活的机制.方法 PCR扩增Csm4基因,构建重组pMV261-Csm4穿梭表达质粒,将重组质粒和空白质粒电穿孔进MS生成重组菌MS_Csm4和对照重组菌MS_V,采用Western blot对重组菌Csm4蛋白表达进行检测.体外培养观察MS Csm4和MS_V生长曲线,并检测活性氮、活性氧环境下的集落形成单位(CFU)变化.MS_Csm4和MS_V重组菌感染人源巨噬细胞THP-1,计数CFU反映胞内存活,实时荧光定量PCR检测诱导性一氧化氮合酶基因(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达.硝酸还原酶法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)释放指标.结果 Csm4蛋白在MS Csm4中成功表达,且其表达不影响MS_Csm4的生长情况;MS_Csm4在体外活性氮、氧环境中CFU下降,与MS_V相比,差异有统计学意义(P＜0.05);重组菌MS_Csm4作用于THP-1细胞后诱导iNOS表达上调,促进NO的释放以及减少胞内生存,与MS_V相比,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 重组菌MS_Csm4不能耐受体外活性氮、氧压力环境,可诱导宿主细胞iNOS表达上调,促进NO释放,从而影响其胞内生存能力.
