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MTB对阿米卡星和卡那霉素耐药相关rrs与eis基因突变的研究
本研究搜集了吉林省全部9个地级市结核病医疗机构2014-2017年内1357株结核分枝杆菌分离株.采用比例法进行Am和Km的药物敏感性试验,并对rrs和eis基因进行PCR和测序分析.发现28株同时耐Km和Am,单耐Km者有2株;其中26株MTB的rrs基因均发生突变,基因突变率为92.86％;6株菌存在eis基因突变,突变率为21.43％.60株对照株未发现基因突变.吉林省MTB对Am和Km存在较高的交叉耐药现象;rrs基因的突变可以作为两者交叉耐药的分子标志,为建立耐Am和(或)Km结核病快速检测技术提供分子基础.
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结核分枝杆菌EIS基因抑制人肺腺癌A549细胞自噬
目的 构建结核分枝杆菌EIS基因表达质粒,探讨其对人肺腺癌A549细胞自噬的影响.方法 采用PCR技术扩增EIS基因片段并插入空载质粒pcDNA3.1-3flag中,双酶切、测序鉴定克隆质粒的正确性；将重组质粒与对照空载质粒分别与自噬体荧光表达质粒GFP-LC3共转染细胞并以自噬诱导剂雷帕霉素处理,荧光显微镜下观察自噬荧光并计数,Western blot检测EIS蛋白及自噬蛋白LC3Ⅱ/I的表达水平.结果 成功构建EIS基因重组表达质粒PcDNA3.1-EIS-3flag,该质粒共转染细胞组自噬荧光小点较对照组明显减少(P＜0.05),重组质粒表达42 ku看到蛋白并可抑制自噬蛋白表达水平.结论 结核分枝杆菌EIS基因可抑制A549细胞自噬的形成,其抑制作用与结核分枝杆菌持留性相关.
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结核分枝杆菌eis基因及其编码蛋白的生物信息学分析
目的 获取结核分枝杆菌(H37Rv)的eis基因序列及其编码蛋白(Eis蛋白)的氨基酸序列,预测和分析该蛋白的结构和功能. 方法 从NCBI BenBank数据库获取eis基因及其编码蛋白序列,利用ORF Finger 工具分析eis基因的开放阅读框;利用Expasy PortParam、SignalP 4.0 Server、TMHMM Server V.2.0、SOPMA、BLAST、SWISS-MODEL、ABCpred、SYFPEITHI以及NetMHCIIpan 3.1 Server等软件对Eis蛋白的生物学特性进行预测分析. 结果 结核分枝杆菌eis基因全长1 164 bp,有7个开放阅读框,长一个被通读,编码387个氨基酸.Eis蛋白分子式C1870H2958N5 50O542S11,等电点(pI)为6.46,属于不稳定、疏水性蛋白;无跨膜区,信号肽切割位点位于第21位氨基酸处;二级结构预测无规则卷曲占30.23％,含有一个保守结构域;建立同源三级模型,GMQE为0.98;预测该蛋白至少含有6个B细胞优势抗原表位和14个优势CTL表位.优势抗原表位数个. 结论 生物学信息学方法预测结核分枝杆菌的Eis蛋白具有优势T、B细胞抗原性表位,所含保守结构域与其功能密切相关.eis基因以及Eis蛋白与结核分枝杆菌抑制细胞自噬及其耐药机制密切相关,可作为抗结核治疗的切入点.
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小毛莨内酯对重组耻垢分枝杆菌eis基因表达的影响
目的 研究小毛莨内酯(Ternatolide,Tern)对重组耻垢分枝杆菌生长增殖及其eis基因表达的影响.方法 将5×105 MS-eis-PMV261接种于LB培养基培养并加入200 mg/L的Tern作为实验组,MS-eis-PMV261单独培养作为对照,不同时间点测量取菌液波长为600 nm的A值,根据所测A值绘制增殖曲线；提取菌液DNA以RT-PCR方法检测Tern对eis基因表达的影响；免疫印迹法SDS-PAGE及Western Blot检测Tern对EIS蛋白表达的影响.结果 Tern对两组重组耻垢分枝杆菌增殖差异无统计学意义(P ＞0.05)；Tern可抑制eis基因的表达(P＜0.05)；SDS-PAGE及Western Blot检测发现Tern可显著降低EIS蛋白的表达(P＜0.05).结论 Tern对重组耻垢分枝杆菌的增殖无影响,但可抑制结核分枝杆菌eis基因及其表达的蛋白.该结果对研究持留性结核分枝杆菌的药物治疗提供了实验依据.
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结核分枝杆菌eis基因对鼠巨噬细胞Raw264.7自噬影响的研究
目的 探讨结核分枝杆菌eis基因对巨噬细胞自噬的影响.方法 将鼠巨噬细胞Raw264.7以自噬体荧光表达质粒GFP-LC3转染,将含eis基因的重组耻垢分枝杆菌MS-pmv261-eis与不含eis基因的耻垢分枝杆菌MS-pmv261分别感染宿主巨噬细胞,透射电镜下观察自噬小体形成情况,荧光显微镜下观察自噬荧光并计数,Western blot检测eis基因表达的蛋白及自噬蛋白LC3-Ⅱ的表达水平.结果 结核分枝杆菌eis基因可抑制感染宿主细胞自噬小体的形成,并显著抑制自噬荧光小点形成(P＜0.05),显著降低了自噬蛋白LC3-Ⅱ表达水平.结论eis结核分枝杆菌eis基因对Raw264.7细胞自噬有抑制作用.
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流式细胞术检测胞内重组耻垢分枝杆菌的活力研究
目的 建立一种快速检测胞内分枝杆菌活力的方法 .方法 将一定量培养至对数生长期的含pMVeis的重组耻垢分枝杆菌感染U937巨噬细胞,以含空质粒的耻垢分枝杆菌为对照,吞噬作用2h后洗去胞外细菌,再分别培养4、12、24和48 h后收集细胞并裂解之.获得的胞内细菌用FDA荧光染料染色后用流式细胞仪检测死亡率,并与平板菌落计数法进行比较.结果 流式细胞仪检测出感染12 h后重组耻垢分枝杆菌胞内死亡率较对照组均有显著下降(P＜0.05),流式细胞仪检测法与平板菌落计数法相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 流式细胞术与传统的平板计数法相比具有快速、敏感、方便的特点,可用于分枝杆菌活菌快速检测.
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结核分枝杆菌eis基因表达对人THP-1细胞细胞因子分泌的影响
目的 研究结核分枝杆菌eis基因表达对人单核巨噬细胞Thp-1细胞的影响,筛选出差异性表达细胞因子,探讨结核分枝杆菌eis基因在单核巨噬细胞致持留的免疫机制.方法 eis基因重组耻垢分枝杆菌MS-pmv261-eis及对照组细菌MS-pmv261感染经PMA诱导分化的人单核巨噬细胞Thp-1细胞;细胞信号传导通路抑制剂用于分析作用机制;ELISA方法检测细胞上清中IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、INF-γ表达水平;筛选差异性表达的细胞因子,RT-PCR进一步确定该细胞因子的基因表达.结果 结核分枝杆菌eis基因可引起IL-10表达增加(P＜ 0.05),而对细胞因子IL-4、IL-6、IL-12、INF-γ的表达无显著影响(P＞0.05),RT-PCR结果也进一步确证了IL-10基因的高表达.2-AP和U0126能明显抑制MS-pmy261-eis(MS-eis)感染引起的IL-10的释放(P＜0.05).结论 结核分枝杆菌eis基因可上调Thp-1细胞IL-10在蛋白水平和基因水平的表达,可能通过MEK1/2或PKR信号通路刺激IL-10的释放来增强机体的免疫功能,其作用可能与结核分枝杆菌持留性有关.
