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MTB对阿米卡星和卡那霉素耐药相关rrs与eis基因突变的研究
本研究搜集了吉林省全部9个地级市结核病医疗机构2014-2017年内1357株结核分枝杆菌分离株.采用比例法进行Am和Km的药物敏感性试验,并对rrs和eis基因进行PCR和测序分析.发现28株同时耐Km和Am,单耐Km者有2株;其中26株MTB的rrs基因均发生突变,基因突变率为92.86％;6株菌存在eis基因突变,突变率为21.43％.60株对照株未发现基因突变.吉林省MTB对Am和Km存在较高的交叉耐药现象;rrs基因的突变可以作为两者交叉耐药的分子标志,为建立耐Am和(或)Km结核病快速检测技术提供分子基础.
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宁波地区耐多药结核分枝杆菌链霉素耐药相关基因rpsL和rrs突变研究
目的 阐明宁波地区耐多药结核分枝杆菌链霉素耐药相关基因rpsL和rrs的分子突变特征,为宁波地区耐多药结核病的有效防控提供科学依据.方法 从宁波市疾病预防控制中心收集67例耐多药结核分枝杆菌临床分离株,包括耐链霉素菌株40株和链霉素敏感菌株27株.采用PCR直接测序法分析rpsL和rrs基因的分子突变特征.对链霉素耐药与基因突变率关系之间的差异采用x2检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 40株耐链霉素菌株中,31株(77.50％)检测到rpsL发生突变.突变位点集中在第43位和第88位密码子;6株耐链霉素菌株(15.oo％)检测到2种不同类型的rrs基因突变,分别为A1401G(7.50％,3/40);A514C (7.50％,3/40).27株链霉素敏感菌株中有4株(14.81％)发生rpsL突变,突变位点集中在第104位和第119位密码子,1株链霉素敏感菌株的rrs基因检测到A1401G突变.耐多药结核分枝杆菌中链霉素耐药株rpsL基因突变率高于链霉素敏感株,两者之间差异有统计学意义(x2=25.387,P＜0.05).结论 宁波地区耐多药结核分枝杆菌对链霉素的耐药与rpsL突变高度相关,耐药基因突变类型存在地域差异.
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应用PCR-SSCP技术检测结核分枝杆菌耐链霉素相关基因rpsL和rrs突变
目的 应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术,建立快速检测结核分枝杆菌链霉素耐药相关基因rpsL和rrs突变的新方法.方法 采用常规药敏试验检测112株结核分枝杆菌临床分离株对链霉素的耐药性,建立PCR-SSCP法检测耐药相关基因rpsL和rrs的突变.采用PCR直接测序技术(PCR-DS)确定rpsL和rrs基因突变情况并与PCR-SSCP法检测结果进行比较.结果 112株结核分枝杆菌临床分离株均携带rpsL和rrs基因,52株(46.4％)对链霉素敏感,其中有1株敏感菌株rrs基因PCR-SSCP条带异常,PCR-SSCP方法的特异性为98.1％ (51/52).60株(53.6％)结核分枝杆菌对链霉素耐药,用PCR-SSCP方法分别检出46株(76.6％) rpsL基因和11株(18.3％)rrs基因条带异常,1株同时出现rpsL和rrs基因条带异常,PCR-SSCP检测的灵敏度为93.3％ (56/60).结论 PCR-SSCP方法检测结核分枝杆菌耐药相关基因rpsL和rrs突变的特异性和敏感性高,临床上值得推广应用.
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应用单链探针反向杂交试验检测结核分枝杆菌耐药性分析
目的 探讨单链探针反向杂交试验检测结核分枝杆菌耐药性,评价此方法在耐药性检测中的临床应用价值.方法 采用聚合酶链反应- 单链探针反向杂交试验技术,PCR 扩增50 株结核分枝杆菌rpoB、katG、rpsL、rrs、embB 耐药基因,将标记生物素的基因扩增产物与固定在硝酸纤维膜上的核酸探针杂交,通过链亲和素碱性磷酸酶,BICP/NBT 显色系统检测分析基因突变,同时与传统药物敏感实验比对分析.结果 PCR-LiPA 方法分析50 株结核分枝杆菌临床分离株,耐RFP 菌株中检出4 株,耐INH 菌株中检出5 株,耐SM 菌株中检出7 株,SM 敏感株检出1 株,50 株rrs 基因均未检测到相应位点的突变;耐EMB 菌株1 株、EMB 敏感株1 株检测到embB 基因突变.结论 应用PCR-LiPA 可快速、简便地检出部分结核分枝杆菌耐药株,可作为临床辅助诊断手段.
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武汉地区结核分枝杆菌氨基糖苷类抗生素耐药分离株rpsL和rrs基因特征分析
目的 阐明武汉地区结核分枝杆菌分离株氨基糖苷类药物耐药相关基因rpsL和rrs的分子突变特征.方法 从武汉医疗救治中心共收集69株结核分枝杆菌的临床菌株,包括耐链霉素(SM)菌株35株(其中4株同时对卡那霉素耐药)和SM敏感菌株34株(其中全敏感20株).采用PCR直接测序法分析rpsL和rrs基因的分子突变特征.结果 35株SM耐药株中有26株(74.3％)检测到rpsL突变,突变位点集中在第43位和第88位密码子,并发现了1个新的突变类型Lys88Glu；13株耐药株(37.1％)检测到四种不同类型的rrs基因突变,分别为A1401G( 17.1％,6/35)、A514C( 14.3％,5/35)、GI487A(2.9％,1/35)和C517T(2.9％,1/35),1株全敏感菌株的rrs基因发生了C1029T突变.卡那霉素耐药株中只有3株检测到了rrs突变,并发现了一种rrs基因尚未见报道的G1487A突变类型.结论 结核分枝杆菌对氨基糖苷类药物的耐药与rpsL和rrs突变相关,耐药基因突变类型存在地域差异.
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重庆市耐多药结核分枝杆菌gyrA与rrs基因突变特征分析
目的 分析重庆市耐多药结核分枝杆菌gyrA、rrs基因突变特征及其与氧氟沙星(ofloxacin,Of x)、卡那霉素耐药(kanamycin,Km)的关系.方法 对89株耐多药结核分枝杆菌的Ofx耐药相关基因gyrA和Km耐药相关基因rrs进行序列测定,分析其基因突变特征.结果 89株MDR结核分枝杆菌中有50株对Ofx耐药,其中46株(92.00％,46/50)gyrA基因发生突变,突变位点包括74、89、90、91和94位密码子;22株耐Km菌株中,19株(86.36％,19/22)发生rrs基因突变,突变类型均为A1401G.Ofx、Km耐药株的gyrA、rrs基因突变率明显高于相应敏感株的基因突变率,两者之间的差异有统计学意义(x2 =62.937,P＜0.001;Fisher双侧P＜0.001).结论 gyrA基因90、91、94位密码子突变是重庆市耐多药结核分枝杆菌Ofx耐药的主要机制;rrs基因A1401G突变则是Km耐药的主要原因.
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结核分枝杆菌链霉素耐药基因突变特征分析
目的 了解广东地区链霉素耐药结核分枝杆菌rpsL、rrs基因突变特征.方法 对137株链霉素耐药、166株链霉素敏感的结核分枝杆菌临床分离株应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增rpsL、rrs基因片段,并进行测序、分析比对.结果 137株链霉素耐药菌株中,118株存在rrs或者rpsL基因突变,突变率86.13％;其中92株存在rpsL基因突变(突变率为67.15％),主要分布在43位氨基酸(70株)与88位氨基酸(20株),其中43位氨基酸突变类型为K→R(AAG→AGG,49.64％)和K→T(AAG→ACG,1.46％),88位氨基酸突变类型为K→R (AAG→AGG,13.14％)、K→T(AAG→ACG,0.73％)和K→Q (AAG→CAG,0.73％),并有2株存在39、43位氨基酸的联合突变,即T→T(ACC→ACT)联合K→T(AAG→ACG)突变(1.46％);47株存在rrs基因突变(突变率为34.31％),包括8种核苷酸突变,主要分布在1401位A→G(13.14％)、514位A→C(8.76％)、517位C→T(6.57％),2株存在514、1401位核苷酸A→C;A→G的联合突变;15株存在rpsL与rrs基因的同时突变;166株链霉素敏感菌株中,7株存在rpsL基因突变,13株存在rrs基因突变.结论 广东地区链霉素耐药结核分枝杆菌株的rpsL、rTs基因突变具有其自身特点,存在地域差异.
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单链探针反向杂交试验技术检测结核分支杆菌链霉素耐药基因
[目的]建立同时检测结核分支杆菌链霉素耐药基因突变的单链探针反向杂交试验技术(PCR-LiPA),同时从分子水平分析结核分支杆菌链霉素耐药性表型与耐药基因rpsL、rrs突变的相关性,评价单链探针反向杂交技术检测结核分支杆菌链霉素耐药性的应用价值.[方法]采集临床标本,按照实验规程培养、鉴定结核分支杆菌,并对分离到的结核分支杆菌进行药敏试验;PCR扩增结核分支杆菌rpsL、rrs耐药基因,单链探针反向杂交试验技术检测耐药基因.将PCR-LiPA方法结果与DNA测序比较验证方法的准确性,将PCR-LiPA方法结果与药敏结果比较.[结果]50株结核分支杆菌传统药物敏感性试验结果显示,15株耐SM.PCR-LiPA方法分析分析结果:耐SM菌株中7株rpsL基因突变、SM敏感株1株rpsl基因突变,rrs基因未发现突变;与DNA测序结果的符合率为100%.[结论]用PCR-LiPA可简便、快速、灵敏、特异地检测出一部分结核分支杆菌链霉素耐药株的rpsL、rrs基因突变,可作为临床结核分支杆菌链霉素耐药性的辅助诊断手段.
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复合PCR-膜芯片技术对结核分枝杆菌链霉素耐药性的快速检测
目的应用复合聚合酶链反应(复合PCR)-膜芯片技术快速检测结核分枝杆菌对链霉素(SM)的耐药性.方法设计与合成用于检测结核分枝杆菌耐SM基因rpsL和rrs的寡核苷酸探针制作膜芯片,与结核分枝杆菌分离株生物素标记的rpsL和rrs基因复合PCR产物进行反向斑点杂交,并与PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)和PCR-直接测序(PCR-DS)结果比较.结果52株结核分枝杆菌临床分离株中,9株敏感株rpsL和rrs基因的SSCP图谱、膜芯片杂交结果与标准株完全相同;43株耐SM菌株中,33株存在rpsL基因43位密码子AAG→AGG突变,5株有rrs基因513位A→C突变,1株有rrs基因513位A→T突变,突变率为90.7%.结论膜芯片技术检测结核分枝杆菌耐SM基因型灵敏度高、特异性强、简便、快速,可用于临床耐药性检测.
