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耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的临床应用
目的 分析耐多药结核病临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在耐药性检测中的临床价值方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性技术分析了同时25株耐异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)的多耐药临床分离株和20株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变结果以结核分支杆菌(H37RV)为对照,20株药物敏感株的rPOB、rpsL基因SSCP图谱正常,其特异性为100%;KatG基因有2株图谱异常,特异性为96.4%.45株结核分支杆菌临床分离株均未发现rPOB、KatG、rpsL基因缺失,其PCR扩增产物SSCP分析结果表明:25株多耐药临床分离株中,23株rPOB基因图谱异常;15株KatG基因图谱异常;19株rpsL基因图谱异常.其敏感性分别为rPOB(92%)、KatG(60%),rpsL(76%)结论结核分枝杆菌耐RFP、INH、SM耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致.
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宁波地区耐多药结核分枝杆菌链霉素耐药相关基因rpsL和rrs突变研究
目的 阐明宁波地区耐多药结核分枝杆菌链霉素耐药相关基因rpsL和rrs的分子突变特征,为宁波地区耐多药结核病的有效防控提供科学依据.方法 从宁波市疾病预防控制中心收集67例耐多药结核分枝杆菌临床分离株,包括耐链霉素菌株40株和链霉素敏感菌株27株.采用PCR直接测序法分析rpsL和rrs基因的分子突变特征.对链霉素耐药与基因突变率关系之间的差异采用x2检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 40株耐链霉素菌株中,31株(77.50％)检测到rpsL发生突变.突变位点集中在第43位和第88位密码子;6株耐链霉素菌株(15.oo％)检测到2种不同类型的rrs基因突变,分别为A1401G(7.50％,3/40);A514C (7.50％,3/40).27株链霉素敏感菌株中有4株(14.81％)发生rpsL突变,突变位点集中在第104位和第119位密码子,1株链霉素敏感菌株的rrs基因检测到A1401G突变.耐多药结核分枝杆菌中链霉素耐药株rpsL基因突变率高于链霉素敏感株,两者之间差异有统计学意义(x2=25.387,P＜0.05).结论 宁波地区耐多药结核分枝杆菌对链霉素的耐药与rpsL突变高度相关,耐药基因突变类型存在地域差异.
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应用PCR-SSCP技术检测结核分枝杆菌耐链霉素相关基因rpsL和rrs突变
目的 应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术,建立快速检测结核分枝杆菌链霉素耐药相关基因rpsL和rrs突变的新方法.方法 采用常规药敏试验检测112株结核分枝杆菌临床分离株对链霉素的耐药性,建立PCR-SSCP法检测耐药相关基因rpsL和rrs的突变.采用PCR直接测序技术(PCR-DS)确定rpsL和rrs基因突变情况并与PCR-SSCP法检测结果进行比较.结果 112株结核分枝杆菌临床分离株均携带rpsL和rrs基因,52株(46.4％)对链霉素敏感,其中有1株敏感菌株rrs基因PCR-SSCP条带异常,PCR-SSCP方法的特异性为98.1％ (51/52).60株(53.6％)结核分枝杆菌对链霉素耐药,用PCR-SSCP方法分别检出46株(76.6％) rpsL基因和11株(18.3％)rrs基因条带异常,1株同时出现rpsL和rrs基因条带异常,PCR-SSCP检测的灵敏度为93.3％ (56/60).结论 PCR-SSCP方法检测结核分枝杆菌耐药相关基因rpsL和rrs突变的特异性和敏感性高,临床上值得推广应用.
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应用单链探针反向杂交试验检测结核分枝杆菌耐药性分析
目的 探讨单链探针反向杂交试验检测结核分枝杆菌耐药性,评价此方法在耐药性检测中的临床应用价值.方法 采用聚合酶链反应- 单链探针反向杂交试验技术,PCR 扩增50 株结核分枝杆菌rpoB、katG、rpsL、rrs、embB 耐药基因,将标记生物素的基因扩增产物与固定在硝酸纤维膜上的核酸探针杂交,通过链亲和素碱性磷酸酶,BICP/NBT 显色系统检测分析基因突变,同时与传统药物敏感实验比对分析.结果 PCR-LiPA 方法分析50 株结核分枝杆菌临床分离株,耐RFP 菌株中检出4 株,耐INH 菌株中检出5 株,耐SM 菌株中检出7 株,SM 敏感株检出1 株,50 株rrs 基因均未检测到相应位点的突变;耐EMB 菌株1 株、EMB 敏感株1 株检测到embB 基因突变.结论 应用PCR-LiPA 可快速、简便地检出部分结核分枝杆菌耐药株,可作为临床辅助诊断手段.
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耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的应用
目的:探讨耐多药结核病(MDR-TB)临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值.方法:采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术分析了同时54株耐异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)的多耐药临床分离株和45株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变.结果:以结核分支杆菌H37RV为对照,45株药物敏感株的rPOB、rpsL基因SSCP图谱正常,其特异性为100%;KatG基因有2株图谱异常,特异性为96.3%.89株结核分支杆菌临床分离株均未发现rPOB、KatG、rpsL基因缺失,其PCR扩增产物SSCP分析结果表明:54株多耐药临床分离株中,49株rPOB基因图谱异常;32株KatG基因图谱异常;40株rpsL基因图谱异常.其敏感性分别为rPOB(90.7%)、KatG(59.3%),rpsL(74.1%).结论:结核分枝杆菌耐RFP、INH、SM耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致.PCR-SSCP技术有望成为结核分枝杆菌耐药性检测的方法之一.
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耐多药结核分支杆菌基因突变在老年结核病病人耐药性检测中的应用
目的 探讨耐多药结核病(MDR-TB)临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在结核病耐药性检测中的应用价值.方法 采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术分析了同时耐异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)的多耐药临床分离株和35株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变.结果 以结核分支杆菌H37RV为对照,35株药物敏感株的rPOB、rpsL基因SSCP图谱正常,其特异性为100%;KatG基因有2株图谱异常,特异性为94.3%.71株结核分支杆菌临床分离株均未发现rPOB、KatG、rpsL基因缺失,其PCR扩增产物SSCP分析结果表明:36株多耐药临床分离株中,32株rPOB基因图谱异常;21株KatG基因图谱异常;26株rpsL基因图谱异常.其敏感性分别为rPOB(88.9%)、KatG(58.3%),rpsL(72.2%).结论 结核分支杆菌耐RFP、INH、SM耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致.PCR-SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的方法之一.
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武汉地区结核分枝杆菌氨基糖苷类抗生素耐药分离株rpsL和rrs基因特征分析
目的 阐明武汉地区结核分枝杆菌分离株氨基糖苷类药物耐药相关基因rpsL和rrs的分子突变特征.方法 从武汉医疗救治中心共收集69株结核分枝杆菌的临床菌株,包括耐链霉素(SM)菌株35株(其中4株同时对卡那霉素耐药)和SM敏感菌株34株(其中全敏感20株).采用PCR直接测序法分析rpsL和rrs基因的分子突变特征.结果 35株SM耐药株中有26株(74.3％)检测到rpsL突变,突变位点集中在第43位和第88位密码子,并发现了1个新的突变类型Lys88Glu；13株耐药株(37.1％)检测到四种不同类型的rrs基因突变,分别为A1401G( 17.1％,6/35)、A514C( 14.3％,5/35)、GI487A(2.9％,1/35)和C517T(2.9％,1/35),1株全敏感菌株的rrs基因发生了C1029T突变.卡那霉素耐药株中只有3株检测到了rrs突变,并发现了一种rrs基因尚未见报道的G1487A突变类型.结论 结核分枝杆菌对氨基糖苷类药物的耐药与rpsL和rrs突变相关,耐药基因突变类型存在地域差异.
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PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌L型rpsL耐药基因
目的 探索尘肺结核患者感染的结核分枝杆菌(MT)L型的耐药基因rpsL突变与耐受链霉素(SM)的关系.方法 用PCR-SSCP方法检测rpsL基因,与采用常规SM药敏试验(AST法)的结果进行对比分析.结果 采用AST法检测,52株结核分枝杆菌L型临床分离株中共有26株(50.0%)耐SM;PCR-SSCP法检出rpsL基因突变率为40.4%(21/52),2种方法检测耐药株的符合率为80.8%.结论 结核杆菌L型对SM的耐药与rpsL基因突变有关.
关键词： 尘肺 结核分枝杆菌L型 耐药 rpsL基因 聚合酶链反应-单链构象多态性分析 -
耐多药结核分枝杆菌临床分离株rpsL基因特征分析
目的 阐明宁波地区耐多药结核分枝杆菌rpsL基因突变特征,为本地区耐多药结核病的有效预防控制提供科学依据.方法 从宁波市疾病预防控制中心共收集67例耐多药结核分枝杆菌临床分离株,包括耐链霉素(SM)菌株40株和SM敏感菌株27株.采用PCR直接测序法分析rpsL基因的分子突变特征.结果 40株耐SM菌株中有31株rpsL发生突变,突变率为77.50％,突变类型主要为Lys43Arg和Lys88Arg;27株SM敏感菌株中有4株发生突变,突变率为14.81％,突变类型主要为Ala119Gly.耐多药结核分枝杆菌中SM耐药株rpsL基因突变率明显高于SM敏感株,两者之间差异有统计学意义(x2 =25.387,P＜0.05).结论 宁波地区耐多药结核分枝杆菌rpsL基因突变与链霉素耐药高度相关,其中Lys43Arg突变是主要突变类型,耐药基因突变类型存在地区差异.
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糖尿病合并肺结核患者耐多药结核分枝杆菌基因突变的检测
目的: 探讨耐多药结核分枝杆茵,临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在糖尿病合并肺结核患者耐药性检测中的应用价值.方法: 采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对41株自糖尿病合并肺结核患者痰液中培养分离的同时耐利福平(RFP)、异烟肼(INH)、链霉素(SM)的多耐药临床分离株和46株对RFP、INH、SM敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变状况.结果: 46株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因SSCP图谱正常,特异性为100%.PCR扩增产物SSCP分析结果显示:41株多耐药临床分离株中,36株rPOB基因图谱异常,26株KatG基因图谱异常,29株rpsL基因图谱异常,检测敏感性分别为rPOB(87.8%)、KatG(63.4%),rpsL(70.7%).结论: 结核分枝杆菌对RFP、INH、SM产生耐药性的机制主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致.
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广东地区临床分离结核分枝杆菌KatG、rpoB、rpsL耐药基因变异研究
目的 本研究主要针对从广东地区500例疑似结核病患者痰液中分离的结核分枝杆菌对异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)耐药情况与其对应的突变基因katG、rpoB、rpsL关系研究.方法 采用PCR和DNA测序法对结核分枝杆菌临床分离株katG、rpoB和rpsL基因进行序列分析.结果 分离得到耐INH 35株、耐RFP 27株、耐SM 25株.INH耐药株katG基因突变率为71.4％ (25/35),RFP耐药株rpoB基因的突变率为81.5％ (22/27),SM耐药株rpsL基因突变率为76％ (19/25)；INH以Ser315Thr突变60％ (21/35)常见,RFP以Ser531Leu突变55.6％(15/27)常见,SM以Lys43Arg位氨基酸突变72％ (18/25)常见.结论 katG、rpoB和rpsL基因突变被证实是广东地区结核分枝杆菌INH、RFP和SM耐药性产生的主要分子机制,PCR-DNA测序法可快速检测结核分枝杆菌INH、RFP和SM耐药性.
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结核分支杆菌rpsL基因突变的快速检测
目的建立快速检测结核分支杆菌rpsL基因突变的方法.方法用聚合酶链反应(PCR)直接从结核分支杆菌基因组扩增rpsL基因,并直接进行测序鉴定.结果用引物P1,P2扩增H37Rv DNA获得约460 bp片段,经序列测定后,显示与GeneBank中公布的序列一致(同源性99%).28株结核分支杆菌耐SM分离株中,20株rpsL基因突变位于43位密码子,另8株分离株未出现rpsL基因突变.结论rpsL基因突变是SM耐药性的重要分子机制,本研究为进一步研究链霉素作用方式和耐药机制提供了有力手段.
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临床分离结核分枝杆菌耐药性质与rpoB、rpsL基因变异的研究
目的:对从疑似结核病患者痰液中分离的结核分枝杆菌的rpoB和rpsL基因突变情况进行研究,分别探讨其与耐利福平(RFP)和耐链霉素(SM)之间的关系.方法:采用PCR和DNA测序法对结核分枝杆菌临床分离株和1株卡介苗株(BCG)的rpoB和rpsL基因进行序列分析.结果:分离得到耐利福平27株,耐链霉素25株,经测序分析,所有利福平、链霉素敏感株rpoB、rpsL基因均未发生氨基酸突变；RFP和SM耐药株rpoB和rpsL基因的突变率各为81.5％(22/27)和76％(19/25)；耐利福平以Ser531Leu突变为常见,突变频率为55.6％(15/27),耐链霉素以Lys43Arg位突变为常见,突变频率为72.0％(18/25).结论:rpoB和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌RFP和SM耐药性产生的主要分子机制,PCR-DNA测序法可快速检测结核分枝杆菌RFP和SM耐药性.
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结核分枝杆菌链霉素耐药基因突变特征分析
目的 了解广东地区链霉素耐药结核分枝杆菌rpsL、rrs基因突变特征.方法 对137株链霉素耐药、166株链霉素敏感的结核分枝杆菌临床分离株应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增rpsL、rrs基因片段,并进行测序、分析比对.结果 137株链霉素耐药菌株中,118株存在rrs或者rpsL基因突变,突变率86.13％;其中92株存在rpsL基因突变(突变率为67.15％),主要分布在43位氨基酸(70株)与88位氨基酸(20株),其中43位氨基酸突变类型为K→R(AAG→AGG,49.64％)和K→T(AAG→ACG,1.46％),88位氨基酸突变类型为K→R (AAG→AGG,13.14％)、K→T(AAG→ACG,0.73％)和K→Q (AAG→CAG,0.73％),并有2株存在39、43位氨基酸的联合突变,即T→T(ACC→ACT)联合K→T(AAG→ACG)突变(1.46％);47株存在rrs基因突变(突变率为34.31％),包括8种核苷酸突变,主要分布在1401位A→G(13.14％)、514位A→C(8.76％)、517位C→T(6.57％),2株存在514、1401位核苷酸A→C;A→G的联合突变;15株存在rpsL与rrs基因的同时突变;166株链霉素敏感菌株中,7株存在rpsL基因突变,13株存在rrs基因突变.结论 广东地区链霉素耐药结核分枝杆菌株的rpsL、rTs基因突变具有其自身特点,存在地域差异.
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单链探针反向杂交试验技术检测结核分支杆菌链霉素耐药基因
[目的]建立同时检测结核分支杆菌链霉素耐药基因突变的单链探针反向杂交试验技术(PCR-LiPA),同时从分子水平分析结核分支杆菌链霉素耐药性表型与耐药基因rpsL、rrs突变的相关性,评价单链探针反向杂交技术检测结核分支杆菌链霉素耐药性的应用价值.[方法]采集临床标本,按照实验规程培养、鉴定结核分支杆菌,并对分离到的结核分支杆菌进行药敏试验;PCR扩增结核分支杆菌rpsL、rrs耐药基因,单链探针反向杂交试验技术检测耐药基因.将PCR-LiPA方法结果与DNA测序比较验证方法的准确性,将PCR-LiPA方法结果与药敏结果比较.[结果]50株结核分支杆菌传统药物敏感性试验结果显示,15株耐SM.PCR-LiPA方法分析分析结果:耐SM菌株中7株rpsL基因突变、SM敏感株1株rpsl基因突变,rrs基因未发现突变;与DNA测序结果的符合率为100%.[结论]用PCR-LiPA可简便、快速、灵敏、特异地检测出一部分结核分支杆菌链霉素耐药株的rpsL、rrs基因突变,可作为临床结核分支杆菌链霉素耐药性的辅助诊断手段.
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复合PCR-膜芯片技术对结核分枝杆菌链霉素耐药性的快速检测
目的应用复合聚合酶链反应(复合PCR)-膜芯片技术快速检测结核分枝杆菌对链霉素(SM)的耐药性.方法设计与合成用于检测结核分枝杆菌耐SM基因rpsL和rrs的寡核苷酸探针制作膜芯片,与结核分枝杆菌分离株生物素标记的rpsL和rrs基因复合PCR产物进行反向斑点杂交,并与PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)和PCR-直接测序(PCR-DS)结果比较.结果52株结核分枝杆菌临床分离株中,9株敏感株rpsL和rrs基因的SSCP图谱、膜芯片杂交结果与标准株完全相同;43株耐SM菌株中,33株存在rpsL基因43位密码子AAG→AGG突变,5株有rrs基因513位A→C突变,1株有rrs基因513位A→T突变,突变率为90.7%.结论膜芯片技术检测结核分枝杆菌耐SM基因型灵敏度高、特异性强、简便、快速,可用于临床耐药性检测.
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PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌耐药性
目的: 探讨耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药性的关系以及聚合酶链反应-单链构象多态性分析(polymerase chain reaction-single strand cinformation polymorphism, PCR-SSCP)方法的临床应用价值. 方法: 用PCR-SSCP方法检测58株结核分枝杆菌临床分离株katG, rpoB, rpsL基因突变并与常规药敏试验检测结果进行对比. 结果: 经常规药敏试验检测,58株结核分枝杆菌临床分离株中共有41株耐药,其中,耐异烟肼(INH)为35株,高耐药株27株;耐利福平(RFP)为31株,高耐药株24株;耐链霉素(SM)有31株,高耐药株26株. 同时耐3种药物的有21株(51.2%),耐2种药物的14株(34.1%),单耐药株6株(14.6%). PCR-SSCP方法对58株临床分离株katG, rpoB, rpsL基因突变的检测率为40%(23/58), 45%(26/58), 38%(22/58),其中检出3个基因同时突变的有13株(32%),2种基因突变的12株(29%),1种基因突变的有10株(23.8%). 常规药敏试验与PCR-SSCP法检出结核分枝杆菌同时耐3种药物的符合率为61.9%(13/21),检出耐2种药物的符合率为85.7%(12/14),检出耐1种药物的符合率为50%(3/6). 高耐药株中突变率为80.5%(62/77),低耐药株中突变率为60%(12/20). 结论: PCR-SSCP方法对耐2种以上药物的结核杆菌检出率较高,且耐药基因突变率随着耐药浓度增高而增高. 将PCR-SSCP法与药敏试验联合应用可互相弥补,已成为临床指导用药的好方法.
