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重组新城疫病毒rNDV-IL15在黑色素瘤治疗中的效果
为了提高重组新城疫病毒抑制肿瘤的效果,本实验拯救获得了重组新城疫病毒rNDV-IL 15.构建prNDV-IL15重组质粒,转染BHK21细胞后,拯救重组病毒rNDV-IL15,并测定病毒生长曲线；rNDV-IL15以0.1 MOI感染B16F10细胞,ELISA法检测细胞上清液中IL15的表达量；MTT法比较rNDV-IL 15和rNDV在体外抑制B16F10细胞的效果,并比较了两者在黑色素瘤肿瘤模型中对荷瘤小鼠的治疗效果.结果表明,rNDV-IL 15构建并成功拯救；病毒生长曲线表明,插入IL15后对病毒的生长无影响；IL15在细胞上清液中有较高的表达,达到(1044.3±27.7) ng·mE-1；rNDV-IL15和rNDV对B16F10细胞的抑制率呈时间依赖性,但两者的抑制率无显著差异；与rNDV相比,rNDV-IL15在体内能较明显地抑制肿瘤生长.结果提示,rNDV-IL15是一种更有效的抗肿瘤制剂.
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表达ESAT-6-gpi和IL-21的B16F10瘤苗免疫鼠伴发自身免疫损伤初探
初步探讨B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗诱导抗肿瘤免疫的同时伴发自身免疫相关毒性作用.采用Western blot方法检测B16F 10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗免疫小鼠自身抗体产生情况；采用免疫荧光技术检测瘤苗免疫小鼠血清对正常小鼠眼、睾丸、皮肤、肝及肾组织冰冻切片的反应；瘤苗免疫小鼠的生殖功能检测.结果显示B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗免疫会引起部分C57BL/6小鼠发生鼠毛色素脱失现象,其免疫血清可同皮肤、睾丸等组织正常成分发生抗原抗体反应,瘤苗免疫过的雌雄小鼠合笼后能够正常繁育子代小鼠.实验说明B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗诱发小鼠产生抗肿瘤免疫反应的同时,部分受试鼠可伴发自身免疫损伤,但对机体并未产生危及生命的严重病理反应.本实验为全面评估B16F10-ES-AT-6-gpi/IL-21瘤苗应用价值奠定了基础.
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表达ESAT-6-gpi和IL-21的B16F10瘤苗的构建及其活性鉴定
为构建膜表达糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定的结核杆菌早期分泌靶抗原6 kD(ESAT-6 )和分泌IL-21的B16F10瘤苗并鉴定其活性,利用重叠PCR法构建pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21重组质粒,以脂质体转染重组质粒到B16F10细胞,G418筛选出阳性克隆,用RT-PCR、免疫荧光、FCM和Western blot检测瘤苗细胞靶抗原表达,用瘤苗细胞培养上清刺激小鼠CD8+ T细胞,检测瘤苗所分泌IL-21的生物学活性.结果表明,pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21重组质粒DNA测序正确,B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗细胞目的基因ESAT-6表达于瘤苗细胞表面,增殖能力未受外源基因导入影响,分泌的IL-21具有生物学活性,为研究膜表达ESAT-6和分泌表达IL-21瘤苗的抗瘤效应奠定了基础.
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小鼠黑色素瘤细胞系B16F10中侧群细胞的分离及其耐药性初探
利用荧光活化细胞分选技术,我们分选小鼠黑色素瘤B16F10细胞系中的侧群细胞(SP细胞)和非侧群细胞(Non-SP细胞),用噻唑兰(MTT)法检测化疗药长春新碱对两群细胞的抑制率,计算半数抑制浓度(IC50),并通过RT-PCR和荧光定量PCR法比较两者ABCG2基因表达量.结果显示,B16F10细胞系中存在0.96%的SP细胞,化疗药长春新碱对SP细胞的IC50是1.26 μg/ml,对Non-SP细胞的IC50是0.37 μg/ml,两者差异有显著性意义(P＜0.05).荧光定量PCR法检测SP细胞的ABCG2分子表达量是Non-SP细胞的6.27倍.结果提示,小鼠黑色素瘤细胞系B16F10中存在SP细胞,其较Non-SP细胞显示出更强的耐药性,SP细胞较高表达ABCG2可能是其耐药机制之一.
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珍珠提取物对黑色素细胞酪氨酸酶活性和黑色素合成的影响
研究珍珠提取物对小鼠黑素瘤细胞内酪氨酸酶活性及黑色素合成的影响,为珍珠提取物在美白领域的应用提供理论依据.实验对珍珠提取物进行了成分分析,并以小鼠皮肤黑色素瘤细胞(B16F10)为细胞模型,采用CCK-8法测定珍珠提取物对黑色素细胞活力的影响,以L-DOPA为底物测定细胞内酪氨酸酶活性,采用比色法测定细胞中的黑色素含量.实验结果:在一定添加量下,珍珠提取物对B16F10细胞没有毒性,且能抑制酪氨酸酶活性,减少黑色素的生成.表明珍珠提取物能有效抑制黑色素合成,达到美白的效果.
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胡桃醌对小鼠黑色素瘤细胞B16F10体内迁移的影响
目的:研究胡桃醌对小鼠黑色素瘤细胞B16F10体内迁移的影响.方法:采用小鼠B16/F10黑色素瘤人工肺转移模型研究胡桃醌对肿瘤细胞血道转移的作用.结果:与溶剂对照组相比,4.5、3、1.5和0.75 mg/kg胡桃醌组显著减少小鼠黑色素瘤B16F10血道转移(P＜0.05),其抑制率分别为27.30％、55.35％、31.52％和25.34％;3 mg/kg胡桃醌与阳性对照组相比,抑瘤率无统计学差异(P＞0.05).结论:胡桃醌可抑制小鼠黑色素瘤B16F10血道转移.
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甘草查尔酮A抑制小鼠黑色素瘤B16 F10细胞增殖机制研究
目的：研究甘草查尔酮 A抑制 B16F10细胞增殖机制。方法 SRB法检测甘草查尔酮A对B16F10细胞增殖影响,Giemsa染色法观察细胞形态变化,比色法检测B16F10细胞内、外黑色素含量,Annexin V-FITC/PI 双染检测细胞凋亡率,流式细胞术测定细胞周期分布,Q-PCR法检测细胞凋亡相关基因B淋巴细胞-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞周期蛋白( Cyclin E2)和细胞周期蛋白依赖性激酶-2(CDK2)的mRNA表达。结果甘草查尔酮A能有效抑制B16F10细胞增殖,呈现浓度依赖性和时间依赖性；随药物浓度增加,细胞增殖速度降低,细胞形态由树突状变为固缩圆球状,并伴有黑色素颗粒物出现,且细胞内、外黑色素含量呈浓度依赖性增加趋势,甘草查尔酮 A 能使细胞阻滞在 G1期,在低浓度时,诱导细胞分化,高浓度时,诱导细胞凋亡；同时,甘草查尔酮A下调凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比率,抑制周期相关蛋白Cyclin E2、CDK2的mRNA表达。结论甘草查尔酮A抑制B16F10细胞增殖机制可能是通过使B16F10细胞G1期阻滞,进而诱导细胞分化和凋亡。
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GPI修饰的ESAT-6核酸疫苗的构建及其免疫功能初探
构建糖基化磷脂酰肌醇(GPI)修饰的结核杆菌早期分泌性抗原靶(ESAT-6)核酸疫苗,初步分析其免疫功能.方法利用重叠PCR法构建pIRES-ESAT-6-gpi重组体,转染B16F10细胞,G418筛选阳性克隆,用RT-PCR、免疫荧光检测转染细胞的ESAT-6抗原表达情况；采集ESAT-6核酸疫苗免疫鼠血清,分别检测抗体滴度和CDC效应,免疫磁珠法分选CD4+和CD8T细胞,CFSE/7-AAD细胞毒实验分析CTL细胞毒活性.结果测序正确的重组体pIRES-ESAT-6-gpi转染细胞后,ESAT-6表达于细胞膜表面.ESAT-6核酸疫苗免疫血清和CD8+T细胞分别通过CDC效应和细胞毒作用杀伤膜表达ESAT-6的B16F10细胞.结论构建的GPI修饰的ESAT-6核酸疫苗能够诱导免疫鼠产生体液和细胞免疫反应,杀伤膜表达ESAT-6的B16F10细胞,为进一步基于该法构建B16F10瘤苗的抗肿瘤免疫效应及机制研究奠定了基础.
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小鼠黑色素瘤B16F10-Red细胞株的建立与生物学特性分析
目的:构建表达香菇珊瑚红色荧光蛋白(discosomasp red fluorescent protein,DsRed)的小鼠黑色素瘤B16F10-Red细胞株,并检测其生物学特性.方法:用GenEscortTMⅡ转染试剂将pDsRed质粒导入小鼠黑色素瘤B16F10细胞,G418加压培养联合极限稀释法建立稳定、高水平表达DsRed的单克隆细胞系.FCM检测B16F10和B16F10-Red细胞的细胞周期.比较B16F10-Red和B16F10细胞的克隆球形成能力和小鼠体内致瘤能力.结果:稳定表达DsRed的小鼠黑色素瘤B16F10-Red细胞株基本保持了其亲代细胞的特征,能在C57BL/6小鼠腹部皮下形成肿瘤并继续生长和转移.结论:B16F10-Red细胞株构建成功,其移植瘤模型成瘤率和转移情况同B16F10肿瘤相比无明显差别.
