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人甲状旁腺激素多肽抗体制备及纯化方法研究
人甲状旁腺激素(hPTH)是维持机体钙磷平衡等生命活动的重要激素, hPTH 1-84、1-34、1-37、44-68、54-84是人体中重要的免疫活性片段[1].HPTH 1-84的分子量为9 500,介于完全抗原和半抗原之间.由于抗hPTH 1-84抗体可测定任何具有免疫活性的hPTH片段, 因此具有重要应用价值.本研究用基因工程表达hPTH 1-84制成3种免疫原,分别免疫家兔后制备抗体,并对特异抗hPTH 1-84抗体和载体BSA抗体的效价进行比较.同时,分别用盐析、Q膜、蛋白A和免疫亲和层析纯化方法对抗hPTH 1-84抗体的纯度、活性和回收率进行研究.
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利用免疫亲和层析技术去除母乳中高丰度蛋白的研究
目的 建立并评价一种去除母乳中高丰度蛋白的方法,使低丰度蛋白得到富集,为通过蛋白质组学技术发现母乳中的重要活性蛋白奠定基础.方法 将母乳作为混合蛋白抗原免疫动物制备多克隆抗体,随后用此多克隆抗体通过免疫亲和层析技术去除母乳中的高丰度蛋白,采用免疫印迹法对免疫亲和层析的效果进行验证.结果 母乳中的4种高丰度蛋白均得到一定程度的去除,建立了去除母乳中高丰度蛋白的新方法.结论通过混合抗原所制备的多克隆抗体可有效去除其中的高丰度抗原,并可使低丰度蛋白得到富集.这一方法也可用于提高血浆等样品中低丰度蛋白的检出效率.
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抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的制备和活性检测
目的 制备抗抗CD3 ScFv单克隆抗体,用以抗CD3抗体的亲和层析纯化及血清中该类抗体浓度的检测.方法 采用常规免疫学方法 制备抗抗CD3 ScFv单克隆体并制备抗抗CD3 ScFv单克隆抗体免疫亲和层析柱,用于抗CD3 ScFv蛋白和去除E-tag的Diabody [CD3×Pgp]的分离纯化.采用FACS法测定分别经抗抗CD3 ScFV抗体免疫亲和层析柱及抗E-tag亲和层析柱纯化的抗CD3 ScFv蛋白和Diabody [CD3×Pgp]对K562/A02和Jurkat细胞特异结合活性.采用间接ELISA法进行抗抗CD3 ScFv抗体特异性结合活性的检测 .结果 抗抗CD3 ScFV单克隆抗体能特异性地与抗CD3 ScFv蛋白结合而不与血清发生反应.经抗抗CD3 ScFV抗体免疫亲和层析柱和经抗E-tag亲和层析柱纯化后的抗CD3 ScFv蛋白均能与Jurkat细胞特异结合.经抗抗CD3 ScFV抗体免疫亲和层析柱纯化的去除E-tag的Diabody [CD3×Pgp]与K562/A02和Jurkat细胞结合的阳性率分别为89.87%和83.95%;与其亲代抗体竞争结合K562/A02和Jurkat细胞后,结合率分别下降为56.30%和43.78%.结论 制备了抗抗CD3单克隆抗体和亲和层析柱,可用于抗CD3抗体的亲和层析纯化及血清中该类抗体浓度的检测.
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水中微量藻类毒素免疫亲和层析法分离
微囊藻毒素-LR( microcystin-LR,MC-LR)是淡水水华过程中由某些种系蓝藻产生的一类天然毒素,其毒性作用表现为肝脏毒性和肿瘤促进作用等[1],对人体健康危害极大.中国颁布执行的GB5749-2006《生活饮用水卫生标准》规定了水中MC-LR的限值为0.001 mg/L.目前,水中MC-LR常用检测方法有ELISA方法和高效液相色谱法.
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人肺癌相关单克隆抗体的制备及其抗原的纯化
目的:研制抗人肺癌细胞(A549)单克隆抗体,并对其所识别的抗原进行免疫亲和层析纯化.方法:以人肺癌细胞系A549免疫BALB/c小鼠,常规融合,以间接ELISA筛选,免疫组化研究单克隆抗体的特性,通过免疫亲和层析纯化所识别相关的抗原.结果:成功获得了一株能够稳定分泌抗人肺癌相关抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B9,并提取了其识别的相关抗原.结论:2B9单克隆抗体及其所识别抗原有可能进一步用于肺癌的实验室诊断.
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不同肽段抗体对IL-17抑制率的比较
目的：设计IL-17疫苗，将其免疫新西兰兔，生产并纯化出针对IL-17的抗体，通过检测抗体的结合率以及对IL-17功能的抑制率，筛选出一种对IL-17功能有高抑制率的疫苗。方法：筛选设计4条IL-17肽段（0001、0002、0003、0004），用设计的4个IL-17的肽段偶联后获得的疫苗免疫新西兰兔，产生针对不同肽段的抗体，用免疫亲和层析的方法，分离纯化抗IL-17抗体；用ELISA检测抗体与IL-17的结合，并对抗体进行中和活性鉴定。结果：IL-17疫苗（0002）免疫新西兰兔产生的抗体能IL-l7特异地结合，并且能够有效地阻断人IL-17刺激HT1080细胞产生IL-6。结论：所制备的IL-17疫苗（0002）所产生的抗体具有高度的特异性、稳定性及中和活性，为针对IL-17为靶点的药物的开发奠定了基础。
关键词： IL-17 疫苗 单克隆抗体 酶联免疫测定法(ELISA) 免疫亲和层析 -
马抗中东呼吸综合征冠状病毒特异性F(ab')2的制备
目的 采用免疫亲和层析技术纯化制备马抗中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)特异性IgG与F(ab')2.方法 以经MERS-CoV病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)对马匹进行多次免疫所制备的高免血清为原料,原核表达的MERS-CoV刺突蛋白S受体结合域(S-receptor binding domain,S-RBD)为抗原蛋白制备免疫亲和柱,提取制备抗原特异性IgG或F(ab')2.间接ELISA法检测各样品的活性,MERS假病毒中和试验检测样品的中和活性,BCA法测定样品的浓度,并计算收率.结果 所制备的特异性IgG与特异性F(ab')2的纯度分别为90.1％和92.8％,收率分别为8.7％和3.07％;在相同的浓度下,所制备的特异性IgG或F(ab')2的活性和中和活性均高于对照组中的血清总IgG或总F(ab')2.结论 成功制备了马抗MERS-CoV特异性IgG或F(ab')2,为建立更加安全与高效的抗MERS-CoV免疫球蛋白F(ab')2制备工艺奠定了基础.
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免疫亲和层析法快速纯化猪瘟病毒抗体
目的 应用免疫亲和层析技术快速纯化猪瘟病毒抗体.方法 将猪瘟病毒接种于猪传代肾细胞PK-15中培养,收获并纯化猪瘟病毒,将其与环氧氯丙烷活化的Sepharose-4B偶联,制备免疫亲和层析柱,从猪瘟病毒高免疫猪血清中纯化猪瘟病毒抗体,分别应用SDS-PAGE和ELISA进行抗体纯度和活性检测.结果 自制免疫亲和层析柱的偶联率为0.36 mg抗原/g载体；纯化的猪瘟病毒抗体纯度高,活性强,抗体回收率占猪血清总蛋白的2.45％.结论 已建立了成本低、可快速有效纯化猪瘟病毒抗体的免疫亲和层析法.
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单链尿激酶型纤溶酶原激活剂单克隆抗体的制备及应用
用99%纯度的单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(scuPA)免疫BALB/c小鼠制备了4株能稳定分泌抗scuPA的IgG1类单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞系G7、E8、D1和A9.检测了这四株单抗的特异性,它们与组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)无反应,与双链尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)的结合力很弱.其中G7细胞株单抗与单、双链结合的差异大.取纯化G7单抗制备亲和层析柱.用此柱直接从培养上清纯化scuPA,得到的scuPA纯度为96.3%,回收率为85.4%,纯化倍数50倍左右,比活1.29×105.纯化方法简单、操作方便、避免了因步骤繁杂造成的scuPA的降解,同时降低了成本.
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基于表位多肽的抗TRIM22抗体的制备及其初步应用
目的 制备抗TRIM22多肽抗体及鉴定其性能.方法 将TRIM22 N端15个氨基酸的多肽(MDFSVKVDIEKEVTC)与钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)偶联.免疫新西兰白兔制备抗血清;将TRIM22多肽与Affi-Gel 10偶联制备免疫亲和层析柱,兔抗血清经亲和层析纯化后得到TRIM22多肽特异性抗体;采用ELISA测定抗体效价、Western blot鉴定抗体特异性,并利用该抗体通过间接免疫荧光实验来检测TRIM22蛋白的细胞内定位.结果 获得了抗TRIM22特异性抗体.Western blot结果显示该抗体能特异识别真核及原核表达的TRIM22蛋白.利用该抗体进行的间接免疫荧光实验发现TRIM22蛋白主要定位在HepG2细胞核中.结论 该抗体的制备为TRIM22分子的功能研究提供了有力的工具.
关键词： TRIM22 多肽抗体 免疫亲和层析 Western blot 间接免疫荧光 -
非融合型重组人骨唾液蛋白在毕赤酵母中的高效表达及纯化
通过正交设计对毕赤酵母GS115/pPICZaAN-hbsp工程菌的发酵条件(菌体密度、甲醇诱导浓度、初始pH值、诱导时间)进行优化.采用重组人骨唾液蛋白(recombinant lauman bone sialoprotein,rhBSP)单克隆抗体与Aldehyde-Resin HP FF介质偶联制备免疫亲和层析柱,纯化非融合型rhBSP,并用Western blotting和补体抑制实验检测非融合型rhBSP的抗原性和活性.毕赤酵母GS115/pPICZαAN-hbsp工程菌佳发酵优化为:菌体密度OD600达到45甲醇诱导剂量为1.5%,pH值6.0,诱导时间2 d,大表达量为0.126 mg/ml.经免疫亲和层析法纯化后,SDS-PAGE显示非融合型rhBSP为43～66 ku的分散条带,纯度在90%以上,Westernblotting显示rhBSP具有良好的抗原性,补体实验证明纯化的非融合型rhBSP活性很好.毕赤酵母GS115/pPICzαAN-hbsp工程菌发酵条件经优化后能高效表达非融合型rhBSP,应用免疫亲和层析方法纯化的非融合型rHBSP纯度好,活性高,为进一步研究非融合型rHBSP打下了基础.
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免疫亲和层析技术及其医药应用进展
综述了免疫亲和层析技术的发展现状,包括层析介质、层析剂制备方法、洗脱方法等的新进展,以及免疫亲和层析技术在制药领域和临床方面的应用,包括抗体和抗原的纯化、临床检测、免疫分析等.
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肾腺苷脱氨酶及其结合蛋白的纯化和性质研究
目的:探讨人肾细胞腺苷脱氨酶(ADA)分子特性.方法:用免疫亲和层析法分离纯化ADA,测氨法测定ADA活性.结果:获得的ADA全酶分子达电泳纯,酶比活力为2 561.41 U/mg,得率26.59%.经SDS-PAGE分析,全酶由45.6 KD的小分子的ADA亚单位和无ADA活性的结合蛋白(ADAbp,其分子量为68.1 KD和108.7 KD)构成.用腺苷或脱氧腺苷为底物,全酶的Km值分别为89μmol/L和67 μmol/L.对氯汞苯甲酸能显著抑制酶活性,二硫苏糖醇可使被抑制的活性得到部分恢复,当腺苷浓度在50～150 μmol/L范围内,ADAbp对ADA活性的抑制率为18.4%～21.5%.结论:人肾细胞中ADA为小分子ADA亚单位和无ADA活性的ADAbp构成的大分子ADA,巯基是该酶活性中心的必需基团,且ADbp对ADA活性有抑制作用.
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稳定同位素稀释-液相色谱-串联质谱法测定啤酒中的3种伏马毒素
目的 建立一种检测啤酒中伏马毒素B1、B2和B3的稳定同位素稀释-液相色谱-串联质谱法.方法 添加稳定同位素(13C)标记内标的啤酒样品先经免疫亲和层析净化,再注入液相色谱-串联质谱仪分析.以乙腈-0.2％甲酸等度洗脱,3种伏马毒素于4.5 min内在C18色谱柱上实现完全分离,以多反应监测模式检测,内标校正曲线法定量.结果 3种伏马毒素的浓度为2.0 ng/ml～ 100 ng/ml时,分析物峰面积和内标峰面积的比值与浓度呈良好的线性关系,相关系数(r) ≥0.998 4.伏马毒素B1、B2和B3的回收率分别为90％～104％、92％～105％和88％～106％,日内精密度分别为2.8％～4.3％、2.5％～4.0％和2.9％～3.5％,日间精密度分别为5.2％～6.9％、5.3％～8.1％和4.8％ ～6.5％,检出限分别为0.22μg/kg、0.21 μg/μg和0.19 μg/kg,定量限分别为0.72 μg/kg、0.68 μg/kg和0.62 μg/kg.结论 所建立的方法准确、特异、灵敏,可用于啤酒中3种伏马毒素的测定.
关键词： 伏马毒素 液相色谱-串联质谱法 同位素稀释质谱法 免疫亲和层析 -
免疫亲和层析-超高效液相色谱法测定大米中4种黄曲霉毒素
目的 建立大米基质中4种黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的超高效液相色谱荧光检测器的测定方法.方法 甲醇水提取大米中的黄曲霉毒素,免疫亲和柱净化富集.C18柱(3.0 mm×50 mm ×1.7 μm)分离,一定比例的甲醇乙腈水等度洗脱,萤光检测器定量检测.结果 黄曲霉毒素B1、G1在0.25 μg/L～ 4.00 μg/L线性范围,黄曲霉毒素B、G2在0.076 μg/L ～ 1.20 μg/L线性范围,相关系数均在0.999及以上.本方法在大米介质中,总黄曲霉毒素检出限为0.04μg/L.不同加标浓度水平的回收率在75％～ 96％,精密度在0.79％ ～ 4.0％.结论 该方法分离度好,分析数据速度快,准确度高,重复性好,适合大米中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的检测分析.
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CD80-IgG融合蛋白的表达、纯化与鉴定
目的构建CD80-IgG融合基因表达载体,表达并纯化该融合蛋白,初步探讨其增强抗肿瘤免疫的作用.方法将小鼠CD80分子胞外段和IgG Fc段cDNA串联起来,定向克隆入质粒pcDNA3.0中,使其在哺乳动物细胞中表达.采用免疫亲和层析法纯化,免疫印迹和斑点ELISA鉴定表达的融合蛋白,流式细胞术、MTT法检测其增强白血病细胞CD80分子表达及促进T细胞增殖的功能.结果DNA测序证明两段基因正确插入质粒载体;亲和层析纯化得到浓度为0.1 mg/ml,纯度为95%的蛋白质溶液;免疫印迹、ELISA表明该蛋白质即为CD80-IgG融合蛋白;流式细胞术证明其能够提高白血病细胞表面CD80分子的表达.结论成功构建融合基因表达载体,表达并纯化出融合蛋白,该蛋白可增强CD80分子的表达.
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应用亲和层析分离纯化人小脑乙酰胆碱酯酶的初步研究
目的 分离纯化人小脑乙酰胆碱酯酶 (AChE).材料和方法 采用ConA和B10亲和层析法纯化人小脑AChE.以纯化的人小脑AChE为免疫原,免疫6只BALB/c小鼠制备小鼠抗人小脑AChE抗血清,并检测其与电鳐AChE和人红细胞膜AChE的交叉免疫反应性.结果 SDS-PAGE还原状态下呈一条主带,相对分子质量为67 000,比活性为373 U/mg.结论 免疫亲和层析法操作简单,可快速纯化人小脑AChE.
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结肠癌相关抗原的制备及其临床意义
目的:从培养的结肠癌细胞LOVO中纯化结肠癌相关抗原, 探讨其在结肠癌患者血清中的表达.方法:裂解结肠癌细胞LOVO, 以抗结肠癌相关抗原单克隆抗体(mAb)4D10作为配基进行亲和层析纯化结肠癌相关抗原, SDS-PAGE电泳和Western blot进行鉴定, 并用双抗夹心ELISA法检测该相关抗原在结肠癌患者及正常人血清中的表达.结果:纯化所获与4D10特异结合的结肠癌相关抗原, 其相对分子质量(Mr)约为65 000, 该抗原由Mr约为30 000和35 000两种亚基组成.人血清检测实验表明,该抗原在结肠癌患者血清中有较高的表达, 与正常人血清相比存在显著的统计学差异(P＜0.01).结论:利用mAb 4D10进行免疫亲和层析, 从结肠癌细胞LOVO中获得纯化的肿瘤相关抗原, 该抗原有可能在临床上为结肠癌的诊断提供一定的参考价值.
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抗rhEPO单克隆抗体的制备及初步应用
目的: 研制抗人促红细胞生成素的特异性单克隆抗体(mAb), 对其生物学特性进行初步鉴定, 并用于转基因羊乳中重组人促红细胞生成素(rhEPO)的提纯.方法: 以自制的rhEPO粗品免疫BALB/c小鼠, 制备抗rhEPO 的mAb.以Western blot和间接ELISA法, 对所获mAb进行初步鉴定.以纯化的mAb同预活化的Sepharose- 4B偶联, 制得mAb亲和层析柱, 并用于转基因羊乳中rhEPO的提纯. 结果: 获得两株可分泌特异性抗rhEPO的mAb的杂交瘤细胞株(1E7和2E6).Ig亚类(型)的鉴定分别为IgG1 和IgG2b, 轻链均为κ型.用Western blot证实, 获得的mAb可特异性地识别rhEPO.用自制的免疫亲和层析柱用于转基因羊乳中rhEPO的提纯, 具有很好的吸附作用, 回收率达70%.结论: 成功地获得两株可分泌特异性抗rhEPO的mAb的杂交瘤细胞.用自制的免疫亲和层析柱提纯转基因羊奶中的rhEPO具有较高的吸附效率.
关键词： 重组人促红细胞生成素 单克隆抗体 免疫亲和层析 -
T6-17细胞培养上清中肿瘤蛋白P185的表达
目的:从转染Her-2/neu基因的T6-17细胞上清中纯化p185蛋白, 研究其免疫原性和探究其在血清学诊断中应用的可能性.方法:采用溴化氰活化的Sepharose 4B为基质, 通过交联A18 mAb, 用亲和层析的技术纯化p185 蛋白.将收集的T6-17细胞上清循环过亲和层析柱, 经梯度盐溶液解离与抗体结合的p185 蛋白, 收集到蛋白洗脱峰, 浓缩后用ELISA检测p185的免疫反应性, 并经SDS-PAGE和Western blot 进一步鉴定.结果:ELISA检测p185保持了良好的与抗体反应活性, SDS-PAGE和Western blot进一步证实纯化蛋白的相对分子质量(Mr)约为185 000, 是HER-2/neu编码的肿瘤抗原.结论:从转基因细胞上清中成功获取p185肿瘤抗原, 可进一步用于乳腺癌的实验室诊断研究.
