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永生化骨髓间充质干细胞的生物学特性
目的:探讨永生化骨髓问充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells.BMSCs)的生物学特性.方法:通过质粒pCMVSV40T/PUR导入大鼠BMSCs,建立永生化BMSCs.在倒置显微镜下观察细胞形态;采用检测碱性磷酸酶的活性,了解永生化BMSCs是否可分化为成骨细胞;采用裸鼠皮下接种实验检测细胞的致瘤性;应用不同血清浓度进行细胞培养及冻存,描绘其生长曲线及复苏后的活性.结果:未导入质粒的BMSCs培养至15代后细胞不能继续传代,呈明显衰老迹象,而永生化BMSCs培养至5代后仍可保持较好的活性,但具有明显接触抑制;永生化BMSCs具有分化为成骨细胞的能力:裸鼠接种后无致瘤性;与其他血清浓度相比,20%血清培养组的细胞生长速度较快;50%及90%血清组其复苏后较20%血清组活性高(P<0.05).结论:在体外,pCMVSV40T/PUR构建的永生化BMSCs具有活性较好等特性,且无成瘤性.可为BMSCs的研究及应用提供大量的细胞来源.
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聚羟基烷酸酯与犬骨髓间充质干细胞的体外相容性
背景:聚羟基烷酸酯是将具有良好生物相容性的高强度高模量的聚羟基丁酸脂与聚羟基戊酸脂按一定比例组合,采用熔铸颗粒沥取法制备的新犁支架,经检测其具有高孔隙度的三维网状结构、良好的生物降解性能等优良特性.目的:评价聚羟基烷酸酯作为组织工程支架与犬骨髓间充质干细胞的生物相容性.设计、时间及地点:体外对比观察实验,于2003-06/2004-03在中山大学组织胚胎实验室完成.材料:聚羟基烷酸酯支架和膜的孔隙率>85%,孔径大小为100～350 μm.方法:原代培养犬骨髓间充质干细胞,传至三四代后,接种至聚羟基烷酸酯膜和泡沫样三维支架上,以单纯细胞培养为对照组.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态;于培养1,2,3周采用40g/L多聚甲醛固定,常规组织切片,苏木精-伊红染色:在培养5,10,14 d用Hoechs33258荧光法定量测定细胞内DNA含量,BCA泫测定蛋白质含量.结果:倒置显微镜观察聚羟基炕酸酯纤维较粗,且透光性差,在相差显微镜下不易观察.第3,4代骨髓间充质干细胞接种全聚羟基烷酸酯膜上2 h后即大部分黏附,3 d后伸展良好,呈纺锤彤或梭形,培养接种1周后,取2个膜状聚羟基烷酸酯固定,苏木精-伊红染色后,见骨髓间充质干细胞增殖可.培养接种2周后,骨髓基质千细胞增殖明显,呈梭形密布于膜状聚羟基烷酸酯上.细胞在聚羟基烷酸酯三维支架的孔隙内立体生长,1周开始细胞间连接,3周广泛连接,分泌大量基质;培养接种3周后,骨髓间充质干细胞增殖较第2周无明显变化.定量测定接种的细胞内DNA含量和蛋向质含量与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05).结论:聚羟基烷酸酯作为骨髓间充质干细胞的组织工程支架材料,具有良好的生物相容性.
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骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的临床研究现状
脊髓损伤是造成截瘫的主要原因和人类致残率高的疾患之一,近几年的动物实验显示BMSCs在治疗SCI中有着良好的应用前景,这些研究成果日益引起国内外学者们的关注,并尝试将其应用于临床,取得了一定的疗效,但长期效果有待随访观察.临床治疗时BMSCs植入的佳时间为SCI后第9 d左右,常用方法有:(1)细胞悬液损伤部位直接注射法;(2)腰穿(经脑脊液)细胞悬液注射法;(3)静脉内细胞悬液输入法;(4)诱导分化后移植.BMSCs移植治疗脊髓损伤的研究刚起步,困难和问题仍然很多,但随着该领域基础研究、临床试验成果和经验的不断积累,BMSCs极有可能在脊髓损伤治疗这一世界难题中发挥出不可替代的作用.
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"肾主骨、生髓"与骨髓间充质干细胞定向分化的研究
目的:通过补肾中药诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化的研究,阐述"肾主骨、生髓"理论.方法:中药药液灌胃SD大鼠4d后经腹主动脉采血制备含药血清.将第4代MSCs以5×106接种于2块6孔板,每板6孔,分为空白组、巴戟天组、杜仲组、补骨脂组、肉苁蓉组、淫羊藿组.细胞长至80%时,各中药组加入含药血清L-DMEM培养基,空白组原培养基继续培养;诱导第10天取出1块6孔板做ALP染色;另一块第20天做6孔板茜素红染色.结果:巴戟天组、杜仲组、肉苁蓉组、淫羊藿组于第10天ALP染色阳性,第14天左右起可见白色钙结节,第20天茜素红染色阳性.结论:以"肾主骨、生髓"理论指导,补肾中药能诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化.
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参附注射液预处理对5-氟胞苷体外诱导兔骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的实验研究
目的 观察参附注射液预处理对5-氟胞苷体外兔骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为心肌样细胞的作用.方法 将18只新西兰大耳白兔,随机分为3组,即参附注射液高、低剂量组,对照组,每组6只,先给予参附注射液(5 mL和1 mL)预处理,对照组给予生理盐水3 mL,兔耳缘静脉注射1周后,经兔双侧骼后上棘抽取兔自体骨髓,并在体外对骨髓间充质干细胞进行分离、培养、扩增.各组细胞均分为两个亚组(A组和B组),每组各3例,细胞接种后24 h,进行诱导分化,参附注射液高、低剂量组中,A亚组分别在常规培养液中加入不同浓度的参附注射液(250,50 μL·mL-1),同时加用5-氟胞苷(5-aza),B亚组分别在常规培养液中加用5-aza,但不加参附注射液;对照组A亚组加用5-aza,B亚组不加任何药物.诱导24 h后连续培养28 d.通过细胞形态学、心肌细胞特异性蛋白(α-肌动蛋白、肌钙蛋白-T)以鉴定诱导分化的效果.结果 培养28 d后细胞爬片经HE染色,光学显微镜下观察培养细胞形态与心肌细胞接近程度,由好到差顺序依次为:参附注射液高剂量A组＞参附注射液高剂量B组＞参附注射液低剂量A组＞参附注射液低剂量B组＞对照组A组＞对照组B组.培养细胞肌钙蛋白T检测显示:同时加入参附注射液及5-aza诱导者骨髓间充质干细胞转化为心肌细胞的阳性强度高于单纯5-aza诱导者,且与剂量有一定的关系,剂量越高,转化为心肌细胞的阳性强度越高;α-肌动蛋白检测显示,同时加入参附注射液诱导者骨髓间充质干细胞转化为心肌细胞的阳性强度高于单纯5-aza诱导,与剂量有一定的关系,剂量越高,转化为心肌细胞的阳性强度越高,但相关性较差,可能与α-肌动蛋白非心肌所特有有关,也可能与样本量较少有关.结论 参附注射液与5-氟胞苷联用时对骨髓间充质干细胞向心肌细胞定向分化产生协同促进效应,提高心肌样细胞阳性转化率.
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兔骨髓间充质干细胞的培养及初步鉴定
目的建立兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)分离、培养和鉴定的方法.方法采用贴壁法培养扩增兔BMSCs,通过形态学观察及流式细胞仪鉴定证实得到的细胞为BMSCs.结果倒置相差显微镜可观察到大量梭形、漩涡状贴壁细胞,流式细胞仪鉴定可见所培养的间充质干细胞高表达其表面标记物CD44,低表达CD14和CD45造血细胞表面标志物,初步证实所培养的细胞为兔BMSCs.结论骨髓贴壁分离法培养间充质干细胞是一种方便快捷、经济有效的培养方式.此种细胞培养方法能够得到较纯化的BMSCs.
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大鼠骨髓间充质干细胞体外成脂分化能力的实验研究
目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞体外成脂分化能力与传代次数的关系.方法:用全骨髓培养法,分离骨髓间充质干细胞,加含有地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1甲基黄嘌呤、吲哚美辛诱导剂的培养液进行诱导,诱导第10天进行细胞形态学观察和油红O染色鉴定,并进行光密度值测定.结果:随着传代次数增加,油红O染色细胞计数值与光密度值均下降.结论:大鼠MSCs成脂能力随传代次数增加而降低.
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大鼠骨髓间充质干细胞诱导为胰岛样细胞体外实验
目的:探讨骨髓间允质十细胞(BMSCs)在不同葡萄糖浓度培养基中诱导效果的差异.方法:采用电镜观察细胞形态学变化、舣硫腙(DTZ)染色鉴定胰岛素分泌细胞的存在;放射免疫分析法观察诱导后BMSCs细胞对葡萄糖刺激试验的反应;免疫细胞化学分析鉴定细胞内胰岛素分泌以及Real-time PCR鉴定胰岛B细胞相关基因mRNA表达水平.结果:电镜观察可见诱导后的细胞具备典型分泌细胞特点,DTZ染色显示各诱导组细胞团为棕红色,细胞浆中富含锌离子,而对照组则无染色,表明胰岛索分泌样细胞的存在.经不同浓度葡萄糖诱导后其吸光度值A值:低糖5.5 mmoL/L诱导组(4.75±1.87).中糖11.1 mmoi/L诱导组(i0.96±2.06),高糖25mmol/L诱导组(12.53 4±2.04),且各诱导组吸光度值A值随着培养基葡萄糖浓度的不断增加,A值也在不断增高.Real-time PCR定量分析结果显示,诱导后胰岛B细胞相关基因GK,PDX-1,ngn3,GLP-1 mRNA的表达水平变化显著,差异具有统计学意义(P<0.01).胰岛素分泌量高糖25 mmol/L诱导组(6.64±0.46)IU/L高于其他各组,差异具显著性(P<0.01).结论:培养基葡萄糖浓度对大鼠BMSCs诱导为胰岛样细胞具有一定影响,以高糖培养基的诱导效果较好.
