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腺相关病毒介导的体内睾丸组织基因特异性敲除系统的建立
目的 建立一套可用于体内睾丸组织特异性敲除基因的系统.方法 利用同源重组技术将CRISPR/Cas9系统中sgRNA功能元件插入到AAV表达载体,将人源Wee12#sgRNA构建入改造的AAV-sgRNA(新版)载体中进行病毒包装,并感染稳定表达Cas9的HeLa-spCas9细胞验证该载体的基因敲除效率.筛选睾丸组织特异表达基因Sycp3的sgRNA靶点,构建入AAV-sgRNA(新版)载体中,进行病毒包装,利用显微注射技术将病毒注射入小鼠睾丸组织曲细精管内,通过T7E1分析体内细胞的基因敲除效果.结果 构建成功的AAV-sgRNA载体能够进行病毒包装并在体外细胞水平上对人源Wee1进行基因编辑,与慢病毒介导的CRISPR/Cas9系统中的载体编辑效率相比无明显差异.同时,该系统能在体内水平对Sycp3进行基因编辑.结论 成功建立一套可用于在体内睾丸组织中进行特异性敲除目标基因的系统,为生殖体内功能研究提供一个新的思路和方法.
关键词： CRISPRCas9 AAV 病毒包装 T7E1 显微注射 -
构建携带大鼠脑红蛋白基因慢病毒载体及其目的基因高效表达
目的 构建携带大鼠脑红蛋白(rat neuroglobin,rNGB)基因的慢病毒真核表达载体pLenti6/V5-rNGB,转染293细胞,观察外源性NGB在293细胞中的表达情况.方法 应用基因重组技术,从大鼠脑组织中获得rNGB基因片段,重组到pLenti6/V5慢病毒真核表达载体上.pLenti6/V5-rNGB经病毒包装,转染至293细胞,而后行rNGB Western blot和免疫细胞化学检测.结果 PCR扩增序列为456bpNGB基因,用Xho-Ⅰ和BamH-Ⅰ进行双酶切显示NGB序列已插入pLenti6/V5慢病毒表达载体,DNA序列鉴定进一步证实插入基因片段的正确性;293细胞转染pLenti6/V5-rNGB后荧光显微镜下发出绿色荧光,证实慢病毒表达载体转入包装细胞;进一步采取Western blot方法和免疫组化方法证实rNGB在包装细胞内有效表达,而pLEGFP-NI转染的细胞只检测到NGB蛋白微弱表达,两组比较有统计学差异(相对表达量分别为25.32±1.05、0,t=-39.63,P<0.01).结论 构建的pLenti6/V5-rNGB,经病毒包装转染至293细胞,rNGB和EGFP基因在细胞内有效表达,为pLenti6/V5-rNGB治疗相关疾病的实验研究奠定了基础.
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基于慢病毒载体系统构建重组JSRV-NM假病毒
目的：采用慢病毒质粒结构重组JSRV-NM假病毒，克服JSRV-NM病毒只能通过绵羊支气管穿刺接种扩增，不能通过体外细胞培养扩增的问题。方法采用慢病毒高效包装系统pMD.G、pCMV-HIV△8.2和pHIV-eGFP，以JSRV-NM病毒的env包膜质粒pCMVJSRV-NM替代VSV-G病毒的包膜质粒pMD.G，转染293T细胞，复制、包装并产出重组的JSRV-NM假病毒。用real-time PCR检测WPRE表达来测定假病毒的滴度，用接种24孔板的293T细胞检测假病毒感染力。结果成功重组了基于慢病毒质粒结构的JSRV-NM假病毒，可超速离心浓缩成高滴度（1×108 TU/mL）的病毒，Lv-JSRV-NM包膜与Lv-VSV-G包膜按感染复数（MOI）=3的比例感染Hela细胞具有相同的感染能力。结论基于慢病毒质粒构建的JSRV-NM假病毒，能够在293T细胞中复制和扩增，产出的假病毒具有稳定性、感染力和安全性，符合二级生物实验室安全的要求。
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pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato重组质粒构建腺相关病毒包装
背景:实验为基因治疗退变椎间盘实验的前期部分,旨在构建含免疫荧光的pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato重组质粒并应用腺相关病毒包装,为后期体内外实验打下基础.目的:构建人SOX9基因过表达腺相关病毒pAAV- hSOX9-IRES- tdTomato的包装.方法:用酶切法将质粒pAAV-IRES- tdTomato和质粒pUC57- hSOX9连接成pAAV-hSOX9-IRES- tdTomato,用质粒共转染方法包装腺相关病毒,感染293AAV细胞,腺相关病毒纯化及用生物学滴度测定法进行滴度测定.结果与结论:经测序结果BLAST比对分析,pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato完全与合成的基因序列hSOX9相符,滴度为1×107TU/mL.结果表明,人SOX9基因过表达腺相关病毒pAAV-hSOX9-IRES- tdTomato包装成功.
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构建线粒体钙离子摄入蛋白1慢病毒表达载体及在H9C2细胞中的应用
背景：线粒体钙离子摄入蛋白1(mitochondrial calcium uptake 1, MICU1)是维持细胞线粒体钙稳态的重要分子，MICU1对线粒体钙稳态的调节可能在糖尿病心肌病的发生及发展中起着重要作用，但目前机制尚不明确。
目的：构建MICU1基因的慢病毒表达载体，产毒感染H9C2细胞，评价MICU1基因在H9C2细胞中的表达效果，为后续在细胞水平研究糖尿病心肌病的发生及发展建立平台。
方法：PCR提取H9C2细胞MICU1基因，SpeⅠ、EcoRⅠ双酶切后，将MICU1基因片段插入慢病毒载体pRRLsin.CMV.eGFP中，构建慢病毒表达质粒pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP。使用pCMVDR8.91、pCMV-VSVG共转染于293T细胞中包装产毒，用于感染H9C2细胞。通过RT-PCR及Western blot检测感染后H9C2细胞中MICU1 mRNA及蛋白的表达。共聚焦显微镜检测Rhod-2染色H9C2细胞后线粒体钙水平。
结果与结论：①MICU1基因成功插入 pRRLsin.CMV.eGFP 慢病毒表达质粒；②转染pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP慢病毒表达质粒后，可见293T细胞表达绿色荧光蛋白，并且MICU1的蛋白表达明显升高；③病毒液感染H9C2细胞后，MICU1的蛋白及mRNA水平较未感染组及空质粒包装组明显升高；④Rhod-2染色后观察发现， MICU1能够明显增强线粒体钙水平；⑤结果表明， pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP慢病毒能够高效感染H9C2细胞，为构建永生化细胞系奠定基础。 -
血管内皮生长因子165基因促进人脂肪间充质干细胞的增殖
背景：目前自体脂肪移植已广泛运用于美容整形和修复创伤导致的软组织缺损的修复，有研究表明，移植后1年移植脂肪存活率为20%-80%，因此，在移植后的早期及时、充分的血供建立，对于移植脂肪的存活是非常重要的。目的：观察血管内皮生长因子165转染人脂肪间充质干细胞的增殖情况。
方法：体外传代培养人脂肪间充质干细胞，将重组血管内皮生长因子165基因入腺病毒液和空病毒液转染至脂肪间充质干细胞内，分别设为实验组和对照组，另设正常培养的细胞为空白组。
结果与结论：RT-PCR，Western blot，MTT 检测显示，与对照组和空白组相比，实验组血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白的表达及细胞增殖均增高(P<0.05)。结果证实，腺病毒承载的血管内皮生长因子165基因转染脂肪间充质干细胞后不仅可以持续的表达目的蛋白，同时也能显著促进脂肪间充质干细胞的增殖。 -
免疫调节因子TIPE2慢病毒载体的构建及病毒包装
目的:TIPE2[Tumor necrosis factor (TNF)-α induced protein 8-like 2 (TNFAIP8L2),TIPE2]慢病毒载体的构建及病毒包装.方法:首先构建带有3×FLAG标签的pCDNA3.1-3×FLAG-TIPE2质粒,确认表达后再将标签连同TIPE2序列一起克隆入pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒表达载体,然后与pMD2.G、psPAX2共转染293T细胞并收获上清,进一步用含病毒颗粒的上清感染PLC/PRF/5及HEK293T细胞,Western blot检测感染后TIPE2蛋白表达情况.结果:pCDNA3.1-3×FLAG-TIPE2及pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro-TIPE2质粒构建成功,并能终产出具有感染性的病毒颗粒.结论:成功构建了TIPE2慢病毒载体并获得具有感染性的病毒颗粒,为进一步研究TIPE2功能提供了有力的支持.
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小鼠全长膜型Klotho蛋白cDNA表达体系的构建与应用
目的 克隆编码小鼠膜型Klotho (mKL)蛋白的cDNA片段,构建、包装Klotho重组腺相关病毒表达体系,并检测rAAV/mKL载体表达功能.方法 选择RT-PCR扩增小鼠全长mKL蛋白的基因片段,将该片段亚克隆至腺相关病毒载体pAAV-IRES-hnGFP,采用酶切及DNA测序鉴定；利用AAV-293细胞包装rAAV/mKL,经转染7901细胞,检测其Klotho表达情况.结果 本文成功克隆出序列信息和读码框完全正确的3 064 bp的小鼠Klotho基因片段,并构建pAAV/mKL克隆.在AAV-293细胞中包装出rAAV/mKL,病毒原液转染7901细胞后其Klotho mRNA表达上调,而细胞上清液Klotho蛋白也明显增加(P＜0.o1).结论 成功构建小鼠Klotho重组腺相关病毒载体(pAAV/mKL),获得了rAAV/mKL,并经转染7901细胞验证其基因表达功能正常,这就为进一步研究Klotho基因治疗衰老相关性疾病提供了技术基础.
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逆转录病毒介导的shRNA对大鼠原代肝细胞PPARα基因表达的抑制
目的 包装能够干扰大鼠氧化物酶增殖物激活受体α(peroxisome proliferater activated receptor α,PPARα)基因表达的逆转录病毒,探索该病毒体外侵染SD大鼠原代肝细胞后,PPARα基因及其下游基因表达的变化情况.方法 包装逆转录病毒,侵染SD大鼠原代肝细胞后抽提总RNA,荧光定量PCR检测PPARα基因及其下游基因cte1的表达.结果 PPARα基因及其下游基因cte1的表达均被抑制.结论 逆转录病毒载体介导的shRNA能够有效地干扰大鼠原代肝细胞的PPARα基因的转录.
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不同转染试剂对制备CAR-T细胞的病毒包装效果比较
目的 为提高制备嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)的病毒包装滴度,比较并确定有效的病毒包装转染试剂.方法 应用氯化钙(CaCl2)、TransintroTM EL、脂质体Lip2000三种质粒转染试剂对逆转录病毒载体质粒MSCV-IRES-GFP(MIG1)、含嵌合抗原受体(CAR)及HA标签的逆转录病毒载体质粒MSCV-IRES(MIG2)、真核表达质粒pIRES2EGFP-DDR1(PDDR1)进行转染,荧光显微镜观察、流式细胞检测上述试剂的转染效率.结果 TransintroTM EL均获得相对较高的转染效率,对MIG1为(43.90±0.57)％,对MIG2为(42.80±0.57)％,对PDDR1为(58.90±0.71)％.而脂质体Lip2000的转染效率均相对较低,对MIG1为(5.20±0.42)％,对MIG2为(9.75±0.07)％,对PDDR1为(22.4±0.28)％.CaCl2在同一转染体系下对不同质粒转染效果不同.结论 对于制备CAR-T细胞的病毒包装,TransintroTM EL试剂能够稳定获得较高的转染效率.
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小鼠免疫共刺激信号B7-1和B7-2联合表达载体的构建及包装
目的 构建含小鼠B7-1和B7-2基因的双表达载体pLXSN-mB7-1-IRES-mB7-2,并包装到PA317细胞中.方法 ①将EcoRI和BamHI酶切下来的pMD18-mB7-2质粒上的mB7-2基因片段克隆到含有IRES片段的MINV质粒上,得到MINV-IRES-mB7-2载体;②MunI酶切载体MlNV-IRES-mB7-2,末端钝化,然后BamHI再酶切,得到含钝末端和BamHI粘末端的IRES-mB7-2基因片段;③XhoI酶切质粒pLXSN-mB7-1,末端钝化,然后BamHI再酶切,形成含钝末端和BamHI粘末端的开环pLXSN-mB7-1质粒,将IRES-mB7-2基因片段插入其中,得到pLXSN-mB7-1-IRES-mB7-2双表达载体;并PA317细胞包装,PCR和电镜鉴定.结果 经酶切、PCR、测序等鉴定载体构建成功,并包装到PA317细胞内.结论 成功得到了双表达载体pLXSN-mB7-1-IRES-mB7-2和包装后的PA317/mB7-1-mB7-2细胞.
关键词： 载体构建 鉴定 病毒包装 pLXSN-mB7-1-IRES-mB7-2 -
TD-IκBα病毒包装及其对肾癌细胞株ACHN增殖和侵袭的影响
目的 构建pLVX-TD-IκBα-IRES-ZsGreen1慢病毒表达载体及包装病毒,观察稳定转染TD-IκBα对肾癌细胞株ACHN增殖和侵袭的影响.方法 从pCFG5-IEGZ-TD-IκBα质粒上获得的目的基因片段克隆入pLVX-IRES-ZsGreen1载体,并进行测序.将慢病毒载体与包装质粒deha8.91和p-VSVG以4∶3∶2比例共转染293T细胞,收集病毒上清并感染肾癌细胞株ACHN,5d后采用Western blot检测TD-IκBα蛋白的表达,使用四唑氮化合物(MTS)和Transwell侵袭实验方法检测细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化.结果 成功构建pLVX-TD-IκBα-IRES-ZsGreen1慢病毒表达载体,包装病毒后成功感染ACHN细胞株,感染组细胞株中的TD-IκBα蛋白显著表达增高.感染组细胞在490 nm处吸光度值明显下降(P＜0.05).细胞迁移和侵袭实验中,相对于阴性对照组穿膜细胞数[(361.400 ±42.379)个和(328.500 ±27.031)个],感染组穿膜细胞数[(252.200±26.142)个和(127.300 ±35.572)个]显著减少(P＜0.05).结论 成功构建pLVX-TD-IκBα-IRES-ZsGreen1重组慢病毒表达载体并包装病毒,过表达TD-IκBα蛋白可显著降低ACHN细胞株的增殖、迁移和侵袭能力.
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重组hTERT腺病毒载体的构建、包装与纯化及其意义
目的 利用分子生物技术构建人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因腺病毒表达载体并检测hTERT基因腺病毒转染细胞的功能表达.方法 用凝胶电泳、测序、Western blotring等鉴定hTERT质粒.用PcR技术扩增hTERT基因,构建hTERT-PIRES2-EGFP基因载体,重组到pAd腺病毒,转染293A细胞扩增病毒.终点稀释分析法测病毒滴度.CsCl连续梯度离心纯化.结果 凝胶电泳、测序和Western blotting检测hTERT基因分子量、序列以及功能是正确的.并且成功构建hTERT腺病毒,病毒浓度达2.1×1012 ifu/mL.结论 成功构建hTERT腺病毒,为hTERT基因治疗的基础研究和动物实验研究奠定了基础.
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稳定过表达、干扰RN181的MHCC97L细胞系建立及RN181功能的初步研究
目的 构建过表达和干扰RN181基因的肝癌MHCC97L重组细胞系,并研究RN181对该细胞体外增殖的影响.方法 基于基因克隆技术,构建plncx2-GFP-IRES/RN181重组载体,常规鉴定后,与pVSV-G共转染GP2-293细胞包装逆转录病毒.该病毒与RN181干扰慢病毒分别感染MHCC97L细胞,流式分选表达绿色荧光的细胞,RT-PCR、Western blotting鉴定后,CCK-8实验和软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖情况.结果 重组载体构建成功,重组细胞荧光良好,RT-PCR、Western blotting分别证实重组细胞中RN181的mRNA和蛋白表达水平在重组细胞系间均出现差异有统计学意义(P＜0.05).增殖实验显示RN181上调后细胞生长减慢,克隆数也显著少于对照组(P＜0.05),而RN181干扰后上述现象可得到逆转.结论 成功构建了过表达和干扰RN181的MHCC97L重组细胞系,初步证实了RN181在体外对MHCC97L细胞增殖的抑制作用.
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Notch1胞内结构域慢病毒表达载体及干扰载体的构建
目的：构建高滴度大鼠N1ICD慢病毒过表达载体（LV-N1ICD）及N1ICD慢病毒干扰载体（LV-N1ICD-shRNA）。方法以大鼠cDNA文库为模板，PCR法扩增N1ICD，通过定向克隆构建pGC-FU-N1ICD-3Flag穿梭质粒；设计4对N1ICD-shRNA寡核苷酸序列，以构建GVC112-N1ICD-shRNA干扰质粒，将pGC-FU-N1ICD-3Flag和GVC112-N1ICD-shRNA共转293T细胞，检测Flag的表达，筛选理想的GVC112-N1ICD-shRNA干扰质粒。将pGC-FU-N1ICD-3Flag或GVC112-N1ICD-shRNA与pHelper 1.0、pHelper 2.0共转293T细胞，以包装LV-N1ICD和LV-N1ICD-shRNA，分别利用Real-time PCR、药物筛选法进行病毒滴度测定。LV-N1ICD及LV-N1ICD-shRNA分别感染H9c2心肌细胞，利用CCK-8检测细胞活力。结果 pGC-FU-N1ICD-3Flag和GVC112-N1ICD-shRNA质粒经PCR、基因测序及Western-blotting验证构建成功，与pHelper 1.0、pHelper 2.0共转293T细胞后，取上清浓缩，分别获得高滴度LV-N1ICD和LV-N1ICD-shRNA。LV-N1ICD可明显提高心肌细胞活力，LV-N1ICD-shRNA可降低心肌细胞活力。结论 LV-N1ICD和LV-N1ICD-shRNA包装成功，具有Notch1信号通路生物学功能。
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大鼠Hes1腺病毒表达载体构建及功能鉴定
目的 构建高滴度大鼠Hes1腺病毒过表达载体(Ad-Hes1).方法 以大鼠cDNA文库为模板,PCR法扩增Hes1,通过定向克隆构建pShuttle-CMV-Hes1穿梭质粒,再以pShuttle-CMV-Hes1为基础,构建pAdeno-Hes1病毒质粒,将pAdeno-Hes1转染293细胞,包装Ad-Hes1,利用改进TCID50法进行病毒滴度测定.Ad-Hes1感染H9c2心肌细胞,Western blot检测Hes1表达.结果 pShuttle-CMV-Hes1穿梭质粒、pAdeno-Hes1病毒质粒构建成功,总滴度为1.6×1011 PFU,Ad-Hes1可在H9c2心肌细胞内正常表达,其MOI值为30.结论 Ad-Hes1包装成功,为进一步研究Hes1的心肌保护作用奠定实验基础.
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大鼠Hes1腺病毒干扰载体构建及功能鉴定
目的 构建高滴度大鼠Hes1腺病毒干扰载体(Ad-Hes1-shRNA).方法 设计3对Hes1-shRNA寡核苷酸序列,通过定向克隆构建pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA干扰质粒,将pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA和pHBAd-BHG共转染293T细胞,以包装Ad-Hes1-shRNA,利用改进TCID50法进行病毒滴度测定.Ad-Hes1感染H9c2心肌细胞,Western blot检测Hes1表达.结果 pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA构建成功,Ad-Hes1-shRNA包装顺利,滴度为1.0×1011 PFU/mL,并可在H9c2心肌细胞内发挥干扰效应.结论 Ad-Hes1-shRNA包装成功,在心肌细胞中具有Hes1的干扰效应.
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IRF3shRNA腺病毒包装及其对RAW264.7细胞IRF3表达的抑制效应
目的 重组并包装干扰素调节因子3(interferon regulator factor 3,IRF3)短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)腺病毒,研究该病毒对RAW264.7细胞IRF3基因表达及对细胞增殖活性和吞噬功能的影响.方法 采用酶切和连接方法构建pAdeno-U6-CMV-EGFP-IRF3 shRNA质粒;借助AdMaxTM病毒包装系统完成IRF3基因干扰腺病毒的重组与包装;IRF3基因表达分别采用real-time PCR和Western blot分析方法检测;RAW264.7细胞的增殖活性和吞噬功能分别采用CCK8分析和吞墨试验检测.结果 IRF3基因的干扰片段及对照序列被正确插入pAdeno-U6-CMV-EGFP质粒Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点之间,经PCR扩增及DNA测序证实;RAW264.7细胞组成性表达IRF3基因,针对IRF3基因后部序列的干扰腺病毒Y2147明显抑制了IRF3 mRNA和蛋白质的表达,而针对IRF3基因前部及中部序列及对照序的干扰腺病毒对IRF3的表达无明显沉默或封闭效应;腺病毒Y2147对RAW264.7细胞的增殖活性及吞噬功能无明显不良影响.结论 成功构建并包装了IRF3shRNA腺病毒,该病毒能有效抑制RAW264.7细胞IRF3 mRNA和蛋白表达,且对细胞的增殖活性和吞噬能力无不良影响.
关键词： 干扰素调节因子3 短发夹RNA 腺病毒 病毒包装 RAW264.7细胞 -
慢病毒载体及其研究进展
慢病毒载体（lentivirus vector, LV）是目前分子及细胞生物实验中非常有效的工具，在基因转染方面有着许多独特的优势，例如，对细胞是否处于有丝分裂期没有特别的要求，基因转染效率高，可容纳较大基因片段等。本文将就慢病毒载体的来源、分子特征及研究进展等进行综述。
