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桑寄生水煎液对小鼠胚胎肢芽生长发育及Tbx2和BMP-2基因表达影响
目的 探讨桑寄生水煎液对小鼠胚胎肢芽生长发育及T-框蛋白2(Tbx2)和骨形成蛋白2(BMP-2)mRNA和蛋白表达的影响,评价桑寄生的胚胎发育毒性.方法 利用超高高效液相色谱仪鉴定药材桑寄生,常规法制成水提液;取E13(embryos on day 13)前肢芽随机分为低、中、高剂量组和空白对照组,分别加入0.5、1和2 mg/ml不同浓度的桑寄生水煎液和双蒸水悬浮培养,72 h后收获肢芽,测量肢芽长度后,阿利新蓝染色用Neubert评分系统进行评分以评价肢芽软骨的发育情况;采用实时荧光定量PCR和免疫组化法分别检测肢芽中Tbx2和BMP-2 mRNA和蛋白的表达水平.结果 ①经UPLC分析,槲皮苷峰面积比为38.45％,可鉴定所用药材为桑寄生.②肢芽长度测量:低、中、高剂量组和空白对照组的长度分别为1091.18±94.32、1107.07±80.29、1118.76±97.49和1080±89.54 μm,各剂量组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).③Neuben评分:低、中、高剂量组和空白对照组总评分分别为223.24±28.32、208.24±28.32、213.30±30.59和201.7±28.94.高剂量组评分高,与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),低和中剂量组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).④实时荧光定量PCR和免疫组化结果显示:各剂量桑寄生水煎液均上调了Tbx2和BMP-2 mRNA和蛋白的表达水平,其中高剂量组与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),而低和中剂量与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 各剂量桑寄生水煎液对小鼠胚胎肢芽的生长发育未体现出胚胎发育毒性,高剂量可诱导Tbx2和BMP-2 mRNA和蛋白表达促进肢芽软骨的发育.
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碱性橙Ⅱ对大鼠胚胎肢芽细胞增殖和分化的影响
目的 探讨碱性橙Ⅱ对13日龄SD大鼠胚胎肢芽细胞增殖和分化的影响.方法 分离13日龄SD大鼠胚胎肢芽细胞进行微团培养,不同浓度的碱性橙Ⅱ(0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0和400.0 mg/L)作用于肢芽细胞,采用CCK8试剂盒检测碱性橙Ⅱ对细胞增殖的影响,采用阿利新蓝8GX染色方法检测碱性橙Ⅱ对肢芽细胞分化的影响.结果 随着碱性橙Ⅱ染毒浓度的增加,胚胎肢芽细胞分化为软骨细胞集落数逐渐减少,细胞增殖率下降,均具有较明显的剂量-效应关系(r细胞毒性=0.958,r细胞分化=0.946);碱性橙Ⅱ对肢芽细胞的半数增殖抑制浓度(pID50)和半数分化抑制浓度(dID50)分别为240.6和69.3 mg/L,对细胞分化的抑制作用大于对增殖的抑制作用.结论 碱性橙Ⅱ对胚胎肢芽细胞的增殖和分化有抑制作用,可能对大鼠胚胎具有潜在的发育毒性.
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羟基脲对大鼠胚胎的肢芽和中脑细胞增殖和分化的影响
目的 观察羟基脲(抗肿瘤药)对大鼠胚胎细胞增殖和分化的影响.方法 用大鼠胚胎的中脑和肢芽细胞,用微团培养法观察不同浓度的羟基脲对其增殖和分化的影响.结果 羟基脲对中脑细胞和肢芽细胞的半数增殖抑制浓度(IV50)分别为5.90、2.48μg穖L-1,半数分化抑制浓度(ID50)分别为2.01、0.67μg穖L-1.羟基脲对胚胎中脑和肢芽细胞增殖和分化具有明显的抑制作用,且呈剂量-反应关系.结论 羟基脲对发育期神经母细胞和肢芽细胞的增殖和分化均具有抑制作用,可能是羟基脲导致中枢神经系统和四肢畸形的作用机制之一.
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生长分化因子-5影响肢芽细胞分化的机制
目的研究生长分化因子-5(growth differentiation factor-5,GDF-5)对肢芽细胞分化的影响机制及在骨形成过程中的作用机制.方法取妊娠第12 d胎鼠肢芽,行肢芽细胞微团培养,以不同浓度(0 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、120 ng/ml)重组鼠GDF-5,干预培养中的肢芽细胞.于细胞培养第1 d、3 d,用扫描电镜观察不同浓度GDF-5对肢芽细胞生长与分化的影响.于细胞培养第3 d,采用免疫组织化学和实时定量PCR等方法观察GDF-5对肢芽细胞核结合转录因子(Cbfa1)与X型胶原蛋白表达的影响.结果在细胞培养第1 d,扫描电镜观察结果显示,GDF-5可使肢芽细胞连接更为紧密,高浓度GDF-5组有成熟软骨基质和软骨结节形成,低浓度组也有软骨结节形成,该效应与GDF-5浓度呈正相关.在细胞培养第3 d,免疫组织化学检测结果显示,X型胶原蛋白表达以120 ng/ml浓度组为广泛和强烈,0 ng/ml浓度组表达弱,其表达趋势接近于Cbfa1的表达,表明GDF-5有促进肢芽细胞向成熟软骨方向分化的作用.实时定量PCR结果显示,GDF-5在mRNA水平同样促进Cbfa1表达,其促进作用呈剂量依赖效应.结论GDF-5通过上调Cbfa1和X型胶原蛋白表达的途径促进肢芽细胞向软骨分化和促进骨形成.
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苯致小鼠胚胎肢芽发育毒作用
目的 研究苯对小鼠胚胎肢芽发育和分化的影响,探讨苯的发育毒性.方法 应用恒温旋转培养装置对12 d孕龄小鼠胚胎前肢芽进行培养,观察不同浓度的苯对肢芽发育和分析的影响,并进行Neubert评分.结果 苯浓度在75μmoL/L以上时,前肢芽的发育和分化受到抑制,且随着苯浓度的增加,肢芽各软骨的发育分化越差,Neubert评分越少,剂量-效应关系良好.结论 苯可抑制小鼠胚胎肢芽发育和分化.
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电磁脉冲对孕鼠及其胚胎的影响
目的:探讨电磁脉冲(electromagnetic pulses,EMP)对孕期小鼠及其胚胎发育的影响.方法:采用不同场强的EMP(分别为0、50、100、200、400 kV·m-1)辐照器官形成期的BALB/c孕鼠,于孕18天解剖小鼠,测量孕鼠体重增长值、脏器/体重,胎盘重、胎鼠体重、身长、尾长,并记录吸收胎、死胎、生长发育迟缓及畸胎的数量.结果:各辐照剂量组孕鼠体重增长值、脏器/体重与对照组相比均无显著性差异(P＞0.05)；胎盘重、胎鼠体重、身长、尾长数值明显低于对照组(P＜0.01).50、400 kV·m-1和100、200、400 kV·m-1辐照组可分别导致死胎率和生长发育迟缓率增加(P＜0.05),在400 kV·m-1的EMP辐照组中,畸胎数也有升高的趋势,其中,畸胎主要表现为肢体和骨发育异常.结论:本实验条件下,不同场强的EMP辐照可对器官形成期小鼠胚胎的生长发育产生一定的影响,胚胎肢芽及骨发育可能是EMP作用的特殊靶点.
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GDF-5在小鼠肢体骨骼发育中的表达及对肢芽细胞影响的研究
目的:初步观察并探讨生长分化因子-5(GDF-5)在小鼠肢体发育过程中的表达及对肢芽细胞软骨分化的影响.方法:RT-PCR法检测小鼠肢体发育过程中GDF-5表达的变化情况;MTT法测定不同浓度GDF-5对体外微团培养肢芽细胞增殖率的影响;Alcian染色在倒置相差显微镜下观察不同浓度GDF-5对肢芽细胞软骨分化的影响,探讨GDF-5影响骨骼系统发育的机理.结果:RT-PCR结果提示GDF-5在胚胎发育的第12、13d高表达,骨骼系统基本形成之后在孕14、15d表达渐下降稳定于一较低水平;不同浓度GDF-5对肢芽细胞增殖率影响不同,50ng/ml浓度组促肢芽细胞增殖作用强;Alcian染色结果显示GDF-5促进肢芽细胞软骨分化的作用呈剂量依赖效应,以120ng/ml组软骨分化快,软骨结节体积大,100ng/ml组软骨结节的数量多.结论:GDF-5在肢体发育的不同阶段表达水平不同,在骨骼系统形成早期及关节系统形成阶段表达强,主要通过影响肢芽细胞增殖及软骨分化而发挥作用.
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先天性马蹄内翻足动物模型胚胎后肢(芽)评分系统的建立
目的 建立一套稳定的评分系统,提供客观的观察指标来确认胚胎早期先天性马蹄内翻足(congenital clubfoot,CCF),进行序列胚胎研究.方法 60只Wistar大白鼠,体重220～250 g,随机分成实验组和对照组各6组.从怀孕第10天起,将维甲酸玉米油混悬液经胃管单次注入,以建立马蹄内翻足动物模型,分别在受孕第13、14、15、16、17、18天取出胎鼠的后肢芽并经过一系列处理.应用评分系统对胎鼠进行评分.结果 经评分系统得出的动物模型CCF发病率为80.9%,经评分系统矫正后的CCF发病率较既往报道高.在实验组和对照组之间的软骨分化存在显著差异.结论 应用评分系统可以有效地筛选出CCF,可以对筛选出的CCF胚胎在关键的研究时间窗口进行系列研究,有效地解决了长期困扰CCF研究难以深入的瓶颈问题.
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胎鼠肢芽软骨染色技术的一点改进
目的：改进阿利新蓝单染胎鼠肢芽软骨技术，尤其是改进后的技术免用对人体有毒或致癌的试剂。方法将SPF级SD大鼠13~16 d龄的胚鼠前或后肢芽用阿利新蓝染液染色、丙三醇透明，后将透明好的肢芽标本用DPX树脂镶嵌在载玻片上待观测。结果胎鼠前肢芽各部分发育分化的软骨均被染成蓝色，标本完全符合在体视显微镜下对肢芽软骨是否畸形的观测及前肢芽软骨半定量Neubert 300分评价标准。结论阿利新蓝单染胎鼠肢芽软骨技术经改进后，肢芽软骨染色好，实验步骤简化、时间缩短、节约成本、安全环保。
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Shh基因在NIPBL+/-胎鼠肢芽内的表达
目的 研究Shh基因在不同孕期NIPBL+/-胎鼠肢芽内的表达情况.方法 采用NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠建造NIPBL+/-小鼠模型,NIPBL+/-小鼠模型进一步杂交获得实验用的亲代鼠,雌、雄按2:1合笼.在孕鼠的E10、E11、E12天,分别采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术鉴定得到6只NIPBL+/-胎鼠的肢芽作为实验组,另取6只NIPBL+/+胎鼠的肢芽作为对照组.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分别检测实验组和对照组Shh基因的表达情况.结果 实验组和对照组胎鼠肢芽内的Shh基因在E10、E11、E12天均有表达,实验组和对照组胎鼠肢芽内Shh基因的ΔCt值由大到小依次为E10天、E12天、E11天,表明在不同的孕期(E10、E11、E12天),实验组和对照组胎鼠肢芽内Shh基因表达趋势均为先升高后下降,差异有统计学意义(P<0.01).在相同的孕期(E10、E11、E12天),实验组Shh基因的ΔCt值大于对照组,差异有统计学意义(P<0.01).结论 NIPBL+/-基因敲除的胎鼠肢芽会抑制其自身Shh基因的表达.
关键词： 基因 基因表达 逆转录-聚合酶链式反应 肢芽 -
锌缺乏与过量对体外培养的小鼠胚胎肢芽发育的影响
目的:观察锌缺乏与过量对体外培养的小鼠胚胎肢芽发育的影响,为锌的合理营养提供实验依据.方法:应用恒温旋转胚胎培养葙对12 d孕龄小鼠胚胎前肢芽进行培养,观察锌缺乏与过量对胚胎肢芽发育的影响,并进行Neubert评分.结果:锌浓度为43.0～ 86.0 μmol/L时,对胚胎肢芽发育具有明显的促进作用；锌缺乏(0.0 μmol/L)能导致胚胎肢芽发育评分下降,肢芽细胞分化,组织器官形态分化均受到不同程度抑制；辞过量(172.0～215 μmol/L以上)时,能使VYS血管形成及神经系统、心脏、肢芽的器官形态分化受抑,所有生长发育和组织器官形态分化指标值均明显低于对照组(P＜0.05)；肢芽各软骨的发育分化差,Neubert评分少.结论:锌缺乏和锌过量均可影响小鼠胚胎肢芽的发育和分化.
