首页 > 文献资料
-
瘢痕灸肝俞穴、足三里穴对原发性肝癌大鼠Wnt10b、Wnt3a表达的影响
目的:探讨瘢痕灸肝俞穴、足三里穴对原发性肝癌大鼠Wnt/β-catenin信号传导通路中Wnt3a、Wnt1ob表达的影响.方法:健康雄性Wistar大鼠随机分成对照组、模型组、阿霉素组、肝俞组、足三里组,通过注射二乙基亚硝胺制备肝癌模型,用RT-PCR检测各组Wnt3a、Wnt1ob表达量,观察肝细胞结构和形态变化.结果:与对照组比较,模型组、阿霉素组、肝俞组和足三里组Wnt3a、Wnt10b表达量均显著升高;与模型组比较,阿霉素组、肝俞组和足三里组表达量降低;与阿霉素组比较,肝俞组、足三里组表达幅度下降;与肝俞组比较,足三里组表达量升高.镜下观察可见,对照组为正常肝细胞,模型组细胞有假小叶形成,阿霉素组有明显增生灶,肝俞组细胞核多形、核浆部分消失,足三里组纤维样变.结论:瘢痕灸肝俞穴、足三里穴对原发性肝癌大鼠有治疗效果,其机制可能是通过调节Wnt/β-catenin信号传导通路中Wnt3a、Wnt1ob的表达量来实现的.
-
Wnt3a减轻黑素细胞iMC65氧化应激损伤
目的 探讨Wnt3a对氧化应激损伤的iMC65黑素细胞的保护作用及机制.方法 将黑素细胞分成对照组, Wnt3a组,H2O2处理组,Wnt3a干预组,750μmol/L的H2O2作用模拟黑素细胞的氧化应激损伤.MTT实验检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞产生活性氧(ROS),荧光素酶报告基因检测Nrf2/ARE通路的激活, Western blot检测Nrf2/ARE通路的相关蛋白表达.结果 与对照组相比,H2O2处理组的细胞活性明显下降(P<0.01),凋亡比率明显上升(P<0.01),ROS的产生明显增加(P<0.01).而Wnt3a干预组能显著缓解H2O2处理组细胞活性的降低(P<0.05)、降低凋亡比率(P<0.05),减少ROS的产生(P<0.05).Wnt3a也能上调Nrf2和HO-1蛋白水平的表达.结论 Wnt3a可以保护氧化应激状态下的黑素细胞,其机制可能与激活Nrf2/ARE有关.
-
Wnt3a与Wnt5a信号途径转换对造血干细胞衰老的影响
造血干细胞(HSCs)衰老是机体造血免疫功能衰老的重要原因,在衰老相关疾病的发生中起着关键作用.一定条件下,经典Wnt3a/β-catenin的激活明显有利于保持HSCs的极性与年轻态、自我更新与增殖、分化能力;非经典Wnt5a信号通路的激活则可通过进一步激活细胞内Cdc42蛋白活化等,促发HSCs 衰老,并间接抑制Wnt3a/β-catenin通路.对Wnt3a向Wnt5a信号通路转换及其干预的研究不但阐释了HSCs衰老发生的机制,更明确了如何延缓衰老,提供了解决衰老相关疾病及保持年轻态的新策略.
-
鸡源Wnt3a融合蛋白表达载体的构建及其对鸡胚脊髓神经前体细胞增殖和轴突形成的影响
目的 构建鸡源Wnt3a融合蛋白真核表达载体(pCAG-MCs-Wnt3 a-EGFP),并探讨其在鸡胚脊髓发育过程中超表达后对神经前体细胞增殖及轴突形成的影响.方法 利用分子生物学手段,提取鸡胚脊髓总RNA并获得Wnt3a片段,将其克隆到pCAG-MCs-EGFP载体中构建pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP表达载体.在鸡胚发育至2.5～3d (E2.5～E3)时,利用鸡胚活体电转技术将pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP(实验组)和pCAG-MCs-EGFP(对照组)质粒分别转入鸡胚脊髓,E4时取材切片,每组5个胚胎组织,采用免疫荧光染色技术检测Wnt3a和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达变化分析Wnt3a与细胞增殖间的关系,根据载体自发绿色荧光蛋白(GFP)观察脊髓神经前体细胞轴突生成情况.结果 pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP表达载体基因测序结果与Gene bank中基因序列一致,将pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP入鸡胚脊髓中发现绿色荧光.在脊髓组织切片水平上,免疫荧光染色结果表明,Wnt3a在鸡胚脊髓中能够超表达.Wnt3a超表达后,与对照组比较,含有轴突的神经元数量明显减少(n=3,P＜0.01),而PCNA的表达量显著增加(n=3,P＜0.01).结论 成功构建了鸡源性Wnt3a融合蛋白真核表达载体,并证实Wnt3a在鸡胚发育过程中促进神经前体细胞的增殖并抑制轴突的形成.
-
2型糖尿病大鼠早期认知功能改变及海马磷酸化N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基、Wnt3a和去整合素金属蛋白酶10表达的研究
目的观察T2DM大鼠早期认知功能改变及海马磷酸化N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基 (p-NR2B)、Wnt3a和去整合素金属蛋白酶10(ADAM10)的表达变化.方法将40只健康雄性SD大 鼠采用随机数字表法分为对照组(Con,n=20),糖尿病组(DM,n=20).Con组以普通饲料喂养8周后单 次空腹腹腔注射柠檬酸缓冲液.DM组以高脂高糖喂养8周诱导IR后腹腔小剂量注射STZ 35 mg/kg, 3 d后测血糖,血糖≥16. 7 mmol/L确诊T2DM.造模成功后10、20 d分别通过Y迷宫、八臂迷宫检测认 知功能改变,17、21、28 d取大鼠海马,Western blot测定海马p-NR2B、Wnt3a和ADAM10的表达.结 果与Con组比较,DM组在Y迷宫自发活动次数为(6. 9±3. 2)次,自主选择率(SA％)为(42. 2± 29. 5)％,差异有统计学意义(P<0. 05);DM组在八臂迷宫的1、3、6 d测试时间分别为(459. 2±143. 5)s、 (357. 3±131. 7)s、(274. 0±145. 1)s,较 Con组延长(P<0. 05),记忆错误(WME)、参考记忆错误(RME) 和总记忆错误(TE)比较,差异无统计学意义(P>0. 05).与Con组比较,DM组各时间点海马中 p-NR2B、Wnt3a和 ADAM10的表达降低(P<0. 05).结论 T2DM大鼠海马中 p-NR2B、Wnt3a 和 ADAM10的表达减少可能参与其早期认知功能的下降.
关键词： 糖尿病 2型 海马 N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基 Wnt3a 去整合素金属蛋白酶10 认知 -
电针对去卵巢大鼠Wnt3a和 β-catenin的基因及蛋白表达的影响
目的 研究电针对去卵巢骨质疏松模型大鼠Wnt3a和β-catenin的蛋白及基因表达的影响.方法 选取60只雌性SD大鼠,随机分为空白组、假手术组、模型组、药物组、针刺组,每组12只.空白组不做任何处理,常规饲养;假手术组只暴露双侧卵巢但不切除;其余3组行双侧切卵巢法建立骨质疏松模型大鼠.造模13周后开始治疗,针刺组取"肾俞"、"脾俞"、"三阴交"、"足三里",每次电针刺激15 min(断续波,2 Hz,1.0 mA)并灌服与药物组相同体积的蒸馏水,每日1次,连续治疗5 d,间隔2 d,20 d为1个疗程,共治疗3个疗程;药物组以戊酸雌二醇水溶液(0.02 mg/mL,1 mL/100 g体质量)灌胃,疗程同针刺组;假手术组、模型组灌服与药物组相同体积的蒸馏水,疗程同针刺组;各组大鼠每周称重1次,以此调整给药剂量.治疗结束后麻醉处死大鼠,分离股骨和胫骨,分别用RT-PCR分析法和免疫组化法检测各组大鼠股骨和胫骨Wnt3a,β-catenin蛋白及基因的表达.结果 模型组Wnt3a和β-catenin蛋白表达量低,与空白组和假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05);经针刺或药物干预后,Wnt3a和β-catenin蛋白表达显著升高,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05);模型组Wnt3a和β-catenin mRNA表达量低,与空白组和假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05);经针刺或药物干预后,Wnt3a和β-catenin mRNA表达显著升高,与模型组比较具有统计学意义(P<0.05).结论 针刺防治绝经后骨质疏松症的分子机制可能是通过调控Wnt3a和β-catenin的基因和蛋白表达水平,从而激活Wnt∕β-catenin信号通路,以此调节骨重建系统的平衡.
-
Wnt3a信号分子对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中端粒酶活性的影响
目的：探索Wnt3 a信号分子对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中端粒酶活性的影响。方法采用密度梯度离心联合贴壁筛选法分离培养SD大鼠股骨骨髓间充质干细胞。传代后通过形态学和流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD45，筛选并鉴定细胞。采用成骨诱导培养基联合不同浓度的wnt3a（5 ng/mL、25 ng/mL、100 ng/mL）诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化，以碱性磷酸酶活性检测评价其成骨分化能力。通过TRAP-ELISA端粒酶活性检测法检测在不同浓度的wnt3a干预下诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中端粒酶活性的表达。结果骨髓间充质干细胞传至第3代后可获得均一性较高的细胞，流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44高表达，CD45低表达。成骨诱导培养基联合不同浓度的wnt3a诱导大鼠BMSCs 7 d后，碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）活性检测结果：与普通成骨诱导培养基相比，含有5 ng/mL及25 ng/mL wnt3a的成骨诱导培养基可显著增加其碱性磷酸酶（ALP）活性（P＜0.05），而含有100 ng/mL wnt3a的成骨诱导培养基则明显抑制其碱性磷酸酶（ALP）活性（P＜0.05）。与普通成骨诱导培养基相比，联合诱导培养基诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程中，端粒酶活性的改变无明显的统计学差异。结论小剂量（5 ng/mL、25 ng/mL）的wnt3a分子能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞成骨分化，而大剂量（100 ng/mL）的wnt3a分子则抑制其成骨分化。骨髓间充质干细胞具有较弱的端粒酶活性，成骨分化过程中其活性逐渐减弱，直至消失；wnt3a信号分子刺激并不能有效激活其端粒酶活性。
-
Wnt3 a 作为新标志物对肝癌诊断和预后的临床价值
目的：分析检测肝细胞性肝癌（ HCC）患者癌组织和血Wnt3a的表达，探讨其对HCC诊断及预后的临床价值。方法以组织芯片、免疫组织化学法及特异性抗体测定法，检测80例肝癌及癌周组织中Wnt3 a表达，结合随访数据评估其预后价值。用酶联免疫吸附法检测肝癌、肝硬化、慢炎肝炎患者血清Wnt3a水平，并与甲胎蛋白（ AFP）比较评估Wnt3a诊断价值。结果定位于胞质和细胞膜的Wnt3a在肝癌组织阳性率为96．3％，显著高于癌周组织的46．3％（χ2＝48．818，P＜0．001）；其表达与肝癌的分化程度、是否伴肝硬化、HBV感染和TNM分期均显著相关（ P＜0．05），高表达者5年生存率显著降低（P＜0．001），为HCC预后的独立预测因素。癌组织合成的Wnt3a分泌入血，其水平大约是肝硬化组4．0倍，慢性肝炎组9．2倍，健康对照组26．7倍，与肝硬化、乙型肝炎病毒（HBV）感染、分化程度、TNM分期和肝外转移等显著相关（P＜0．05）；如以800 ng／L为正常上限，诊断肝癌的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值和阴性预测值分别为92．5％，94．3％，93．2％，96．1％和89．3％，与AFP联检提高阳性率至96．3％；ROC曲线下面积为0．99显著高于AFP的0．71（ P＜0．001）。结论 Wnt通路关键信号分子Wnt3a表达与肝癌进展密切相关，为新HCC特异诊断和预后的标志物。
-
姜黄素通过Wnt/β-catenin信号通路抑制晶状体上皮细胞增殖的实验研究
[目的]探讨姜黄素通过Wnt/β-catenin信号通路对人晶状体上皮细胞（LECs）增殖的影响及其可能的作用机制，为晶状体后囊膜混浊（PCO）的临床治疗提供新的靶点。[方法]人LECs系SRA 01/04细胞为研究对象，实验分为3组：Wnt3a组，姜黄素组和对照组。Wnt3a组采用脂质体介导转染技术将Wnt3a cDNA表达载体瞬时转染入人SRA 01/04细胞中，构建PCO的细胞模型。姜黄素组在转染Wnt3a cDNA表达载体48 h后加入20μmol/L姜黄素，对照组转染pcDNA3-HA表达载体。采用Western blot技术验证载体在转染细胞中的表达，CKK-8实验检测姜黄素对SRA 01/04细胞增殖能力的影响，采用免疫细胞化学法检测Wnt3a过表达后增生细胞核抗原（PCNA）蛋白表达的变化；Western blot法检测Wnt3a过表达对Wnt/β-catenin下游信号分子cyclin D1和c-Myc蛋白表达的影响；应用免疫荧光法检测Wnt3a过表达后β-catenin表达的定位变化。[结果] Western blot检测证实，转染pcDNA3-HA表达载体后,SRA 01/04细胞内Wnt3a蛋白表达明显升高。CKK-8检测表明，姜黄素组SRA 01/04细胞的增殖率明显低于Wnt3a组（t=2.782，P=0.049）。姜黄组SRA 01/04细胞PCNA蛋白表达阳性率为23.6%±4.0%，明显低于Wnt3a组的43.4%±5.4%，差异有统计学意义（t=2.951，P=0.018）。转染后48 h，β-catenin蛋白密集分布于Wnt3a组细胞核和细胞质中，而在对照组仅出现于细胞之中，姜黄素组β-catenin蛋白主要分布于细胞核中，少量分布于细胞质中。Western blot检测姜黄素组Wnt/β-catenin信号通路靶蛋白Cyclin D1和c-Myc蛋白表达明显低于Wnt3a组。[结论]在SRA 01/04细胞中，姜黄素抑制Wnt3a过表达诱导的Wnt/β-catenin信号通路活化，下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc表达下调，抑制人LECs的增生。
-
Wnt3a转基因骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞增殖的影响
目的 观察Wnt3a转基因小鼠骨髓间充质干细胞(MSC)对T淋巴细胞增殖的影响.方法 从C57BL/6小鼠骨髓中分离培养MSC,用流式细胞术检测细胞表面标志并在不同诱导条件下进行成骨和成脂分化鉴定；采用AdEasy系统将携带Wnt3a基因的重组质粒以脂质体法转染HEK293细胞,收集病毒液感染MSC,以含绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)作对照,荧光显微镜下观察GFP的表达,Western blot检测MSC中Wnt3a和β-catenin蛋白表达；制备BALB/c小鼠脾淋巴细胞悬液,Wnt3a转基因MSC、Ad-GFP转导MSC分别按1∶100、1∶50及1∶10比例和ConA刺激的脾淋巴细胞共培养,48 h后应用CCK-8法、ELISA法检测T淋巴细胞的相对增殖率和培养上清中细胞因子含量变化.结果成功获得MSC,细胞表型检测为CD44+、CD90.2+、CD34-、CD45-,诱导后可向成骨细胞、脂肪细胞分化；包装的腺病毒滴度达1×1010 pfu/ml,病毒液感染MSC后72 h GFP表达强,感染效率为50％～60％.Western blot结果显示Wnt.3a转基因MSC中Wnt3a和β-catenin蛋白的表达水平明显增强；MSC对T淋巴细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性,在MSC与脾淋巴细胞比例为1∶10时,Ad-GFP转导MSC组T淋巴细胞增殖率为(55.41±1.75)％,IFN-γ分泌量为(326.70±14.41)pg/ml；Wnt3a转基因MSC组T淋巴细胞增殖率为(37.27±2.66)％,IFN-γ分泌量为(218.80±12.93)pg/ml,但各组MSC对IL-2的分泌无明显影响.结论 Wnt3a转基因MSC较Ad-GFP转导的MSC抑制T淋巴细胞增殖的作用更显著.
-
miRNA-15a通过靶向Wnt3a调控Wnt/β-catenin信号通路抑制卵巢癌的发展和转移
目的:研究在卵巢癌发展转移进程中miRNA-15a的作用,并探讨其作用机制.方法:收集锦州医科大学附属第一医院2012年5月至2015年6月32例卵巢癌患者的手术切除标本,采用RT-PCR检测miRNA-15a表达.将培养的卵巢癌SKOV-3细胞分为转染miRNA-15a模拟物的实验组和转染无义miRNA的对照组,采用CCK8、Transwell及流式细胞术检测细胞增殖、侵袭和凋亡的变化,采用Western blot法检测相关蛋白表达.通过生物信息学方法预测miRNA-15a靶基因,采用双荧光素酶报告基因实验结合Western blot法验证miRNA-15a对靶基因的调控.检测Wnt3a与miRNA-15a模拟物共转染SKOV-3细胞后对细胞增殖和侵袭的影响.结果:与癌旁组织中的miRNA-15a相对表达量0.692±0.228相比,显著低于卵巢癌组织中的0.911±0.209,差异具有统计学意义(P<0.05).与对照组细胞增殖能力相比,miRNA-15a过表达显著抑制实验组细胞增殖能力,差异具有统计学意义(P<0.05).与对照组189.667±14.742相比,miRNA-15a过表达显著抑制实验组的细胞侵袭能力96.667±13.614,差异具有统计学意义(P<0.05).miRNA-15a过表达实验组的细胞凋亡率27.400％±0.854％显著高于对照组细胞凋亡率6.933％±0.379％,差异具有统计学意义(P<0.05).miRNA-15a模拟物下调Wnt3a和β-catenin的表达,抑制细胞周期蛋白(Cyclin D1)和血管内皮生长因子(vascu-lar endothelial growth factor,VEGF)的表达,促进E-钙离子依赖的细胞黏附素(E-calcium-dependent adhesion,E-cad)的表达.双荧光素酶报告基因实验和Western blot结果表明miRNA-15a靶向抑制Wnt3a表达.上调Wnt3a能显著降低miRNA-15a对卵巢癌细胞增殖、侵袭和对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用.结论:miRNA-15a通过靶向Wnt3a调控Wnt/β-catenin信号通路的激活以抑制卵巢癌的发展和转移.
-
Wnt3a在慢性牙周炎中的表达及临床意义
目的：探讨Wnt3a在慢性牙周炎患者牙龈组织中的表达及其与附着丧失的关系。方法选择15例慢性牙周炎患者（牙周炎组）和15例牙周健康者（对照组），临床检查记录2组的探诊深度和附着丧失水平，采用RT-PCR和Western-Blot检测牙龈组织中Wnt3a的表达水平，并分析Wnt3a蛋白表达与附着丧失的相关性。结果牙周炎组的探诊深度高于对照组（mm：7.93±1.56 vs 1.83±0.37），其临床附着丧失为（7.76±1.34）mm，而对照组的口腔检查中未见临床附着。与对照组比较，牙周炎组的牙龈组织中Wnt3a mRNA（0.49±0.03 vs 0.36±0.04）和蛋白的表达水平（0.57±0.14 vs 0.43±0.17）均较低（t分别为12.015和2.381，P＜0.05）。并且，附着丧失的程度与牙周炎患者牙龈组织中Wnt3a蛋白的表达呈负相关（r=-0.564，P=0.028)。结论 Wnt3a在慢性牙周炎中表达下调，与慢性牙周炎的附着丧失有密切关系，可能在慢性牙周炎的骨吸收中起到了一定的作用。
-
局灶性脑缺血-再灌注大鼠Wnt3a蛋白表达的变化
目的：观察局灶性脑缺血-再灌注大鼠Wnt3a蛋白表达的动态变化。方法：取80只SD大鼠，采用改良的Zea Longa线栓法栓塞大脑中动脉，缺血30 min后再灌注（reperfusion）3、6、12、24 h，3、7、14、28 d，按随机数字法分组。假手术组除未栓塞大脑中动脉外，其余操作与模型组相同。免疫印迹法分别检测各组大鼠皮质Wnt3a蛋白表达情况。结果：与假手术组相比，Wnt3a的表达从缺血-再灌注后12 h开始升高，在24 h时达到高峰，之后7 d内维持较高水平，但14 d后下降，直至28 d时表达仍高于假手术组。结论：局灶性脑缺血-再灌注后，大脑皮质区Wnt3a的表达随时间而动态变化，提示可能激活了Wnt3a参与的调节神经发生的信号通路。
-
Wnt3a在大鼠骨髓源性胆碱能神经元中的表达
目的 通过研究大鼠骨髓基质细胞诱导的胆碱能神经元中Wnt3a的表达变化,了解Wnt3a在胆碱能神经元诱导分化过程中的作用,揭示神经元分化过程中可能的信号通路.方法 取Wistar雄性大鼠的股骨骨髓,培养骨髓基质细胞,经三代纯化CD71免疫细胞化学鉴定后进行分组实验.实验共分四组:骨髓基质细胞组,未加任何诱导因子;胆碱能神经元诱导分化组,加入Shh,RA和bFGF诱导基质细胞向胆碱能神经元分化,并用ChAT鉴定胆碱能神经元;神经干细胞诱导组,加入bFGF、EGF和RA诱导基质细胞为神经干细胞;自然分化组,加入血清诱导分化.提取细胞总RNA,利用RT-PCR进行Wnt3a的半定量分析.结果 与对照的骨髓基质细胞组,神经干细胞诱导组及自然分化组相比,Wnt3a在胆碱能神经元组中表达高并且有统计学差异.结论 Wnt3a在骨髓基质细胞来源的胆碱能神经元中高表达,提示Wnt3a可能是胆碱能神经元分化的Wnt信号通路中的一个环节.
-
Wnt3a转染小鼠胸腺激酶缺陷细胞及对β-连环素蛋白亚细胞分布的影响
背景:Wnt信号通路是动物胚胎发育过程中重要的调控通路,建立Wnt信号通路细胞模型对于研究该通路有重要意义.目的:以Wnt3a真核表达质粒转染小鼠胸腺激酶缺陷细胞,构建能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型,观察经典Wnt信号通路对β-1连环素蛋白亚细胞分布的影响.方法:将扩增真核表达质粒pgk-Wnt3a-pcDNA3.0进行酶切鉴定.应用脂质体转染技术将真核表达质粒pgk-Wnt3a-pcDNA3.0和对照质粒pgk-neo-pcDNA3.0转染入胸腺激酶缺陷细胞,经过G418筛选后挑出细胞克隆,扩大培养.应用RT-PCR技术检测表达产物,应用间接免疫荧光技术检测Wnt3a对鼠胸腺激酶缺陷细胞β-catenin亚细胞分布的影响.结果与结论:Wnt3a质粒经过酶切鉴定证明所扩增的质粒为目的质粒.经过G418筛选3周后,挑选10个稳定转染的细胞克隆,进行RT-PCR检测,可见在L-Wnt3a细胞的cDNA产生1条长度为320 bp亮带,表明扩增产物为所需要的目的片段,Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞后有Wnt3a在mRNA转录水平表达.转染对照质粒的胸腺激酶缺陷细胞cDNA未扩增出目的条带.免疫荧光检测可见Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞后细胞浆中有Wnt3a蛋白表达,转染对照质粒组无表达.Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞核中可见明亮的红色荧光,提示β-连环素蛋白在胸腺激酶缺陷细胞-Wnt3a细胞聚集并进入细胞核中.转染对照质粒的胸腺激酶缺陷细胞浆未见有明显β-连环素蛋白着色,细胞核中无β-连环素蛋白的聚集.构建了能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型,真核表达Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞能够获得稳定表达,促进胸腺激酶缺陷细胞浆中β-连环素蛋白向细胞核转移.
-
体外培养大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化:Wnt3a信号分子的诱导作用
背景:Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节.已有证据显示此通路参与了对神经前体细胞增殖、分化以及决定细胞命运的调控.目前有关Wnt信号通路对间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用还少见报道.目的:寻找促进间充质干细胞向神经元样细胞分化的Wnt信号分子.方法:采用密度梯度离心法在体外分离培养SD大鼠股骨间充质干细胞并培养.传代后通过形态学和流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD34、CD45,筛选并鉴定培养细胞.采用神经营养因子碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a和Wnt5a诱导方案,通过免疫组化和RT-PCR的方法比较Wnt3a、Wnt5a在间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中的作用,以碱性成纤维细胞生长因子单独培养为对照.结果与结论:间充质干细胞经培养、传代后,细胞贴壁生长,形态均一,呈长梭形,流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44高表达,CD34、CD45低表达.Wnt3a诱导后细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶呈阳性,胶质纤维酸性蛋白无明显表达,诱导后细胞的活力良好;Wnt5a诱导组及对照组巢蛋白呈弱阳性表达,神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性.RT-PCR结果显示,Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后5d可见明显的扩增条带,10d后更加明显;胶质纤维酸性蛋白在诱导10d后有比较弱的扩增条带出现.结果说明Wnt3a分子能够促进体外培养的间充质干细胞向神经元样细胞分化.
-
Wnt3a促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化
背景:Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节,但与骨髓间充质干细胞神经分化的联系并不十分明确.目的:寻找促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的Wnt信号分子.方法:首先体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞并传代,行形态学观察,并以流式细胞学方法检测细胞表型CD44,CD9,CD34和CD45.采用碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a或Wnt5a的方案诱导分化,应用免疫组化和反转录-聚合酶链反应方法比较Wnt3a和Wnt5a对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的影响.结果与结论:骨髓间充质干细胞为长梭形,CD9,CD44高表达,CD34,CD45低表达.Wnt3a诱导组的巢蛋白和神经元特异烯醇化酶呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白无明显表达,诱导后细胞的活力良好.Wnt5a诱导组巢蛋白呈弱阳性表达,而神经元特异烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性.反转录-聚合酶链反应结果显示,Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异烯醇化酶在诱导后5 d可见明显的扩增条带,10 d后更加明显.胶质纤维酸性蛋白在诱导10 d后出现较弱的扩增条带.Wnt5a组、对照组骨髓间充质干细胞在诱导后10 d巢蛋白有微弱表达,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白几乎无表达.提示Wnt3a分子能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化.
-
Wnt信号途径促进脂肪间充质干细胞向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化
背景：脂肪间充质干细胞向Ⅱ型肺泡上皮细胞定向分化的能力以及调节机制尚未完全阐明。
目的：观察脂肪间充质干细胞在体外分化为Ⅱ型肺泡上皮的能力以及W nt途径对分化的调节作用。
方法：取大鼠脂肪组织，体外分离培养脂肪间充质干细胞并通过流式细胞术进行鉴定。实验分为对照组、小气道生长液组和Wnt3a组，对照组用普通DMEM培养基培养，小气道生长液组和Wnt3a组均使用小气道生长液培养，且Wnt3a组加入Wnt信号通路激动剂Wnt3a培养。诱导10 d后分别通过qRT-PCR和免疫荧光检测Ⅱ型肺泡上皮标志物肺表面活性蛋白B，C，D的表达，并于诱导5 d和10 d时通过Western blot检测磷酸化β-catenin和GSK-3β。
结果与结论：大鼠脂肪组织中可成功分离出纯度较高的脂肪间充质干细胞，可表达 CD44和 CD29，不表达CD11b和CD45；经小气道生长液诱导后，脂肪间充质干细胞中肺表面活性蛋白B，C，D蛋白和mRNA表达均上调(P <0.01)，表明其可被诱导为Ⅱ型上皮细胞；加入Wnt3a后，经诱导的脂肪间充质干细胞中肺表面活性蛋白B，C，D蛋白和mRNA表达均高于小气道生长液组(P <0.01)，且在诱导过程中磷酸化β-catenin表达随时间逐渐上调而GSK-3β表达逐渐下调(P <0.01)。结果证实，Wnt信号通路在脂肪间充质干细胞诱导分化为Ⅱ肺泡上皮细胞过程中激活并促进干细胞的定向分化。 -
持续Wnt信号通路激活促进胚胎干细胞源造血干细胞的增殖
背景：如何提高胚胎干细胞诱导效率、促进胚胎干细胞源造血干细胞体外增殖成为目前急需解决的课题。
目的：以外源性Wnt3a作为诱导剂，激活培养中的小鼠胚胎干细胞Wnt/β-catenin信号通路，观察该通路的激活是否促进胚胎干细胞向造血祖细胞的定向分化。
方法：用外源性wnt3a(100μg/L)持续作用ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞21 d，通过细胞免疫荧光及蛋白免疫印迹检测细胞内β-catenin蛋白含量，QRT-PCR检测Wnt下游靶标基因的表达量来确定经典Wnt/β-catenin信号通路是否被激活，然后采用单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化，流式细胞仪检测造血发育相关表面标志CD34+/Sca-1+，同时以QRT-PCR法检测造血相关基因的表达情况。
结果与结论：ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞经wnt3a(100μg/L)连续培养21 d后发现β-catenin蛋白在细胞内积累；Wnt信号通路的下游靶标基因Pitx2、Frizzled、Sox17、Oct4的表达量均出现不同程度的增加，可见经典 Wnt/β-catenin 信号通路有被激活；单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化的过程中检测到CD34+/Sca-1+细胞含量在14 d时占总细胞量高达20.2%，而对照组的仅占11.9%。造血相关基因骨形态发生蛋白4、FLK2及CD34的表达量均增加，而Smad5的表达则明显受到抑制。说明Wnt3a持续作用可激活Wnt/β-catenin信号通路，并促进ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的定向分化。 -
Wnt3a对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制研究
目的 探讨Wnt3a对人骨髓间充质干细胞成骨分化及Wnt/β-catenin信号通路的影响.方法 采用成骨诱导培养基联合Wnt3a蛋白(10 ng/mL)诱导人骨髓间充质干细胞分化,通过镜下形态学和茜素红染色评价成骨分化水平.采用实时PCR及Western blotting法检测Wnt3a干预下骨髓间充质干细胞分化过程中第1、5、10、15和20天RUNX2、β-catenin及BSP的表达情况.结果 Wnt3a干预下充质干细胞向成骨细胞分化程度明显高于对照组.Wnt3a能提高RUNX2、β-catenin及BSP mRNA和蛋白的表达水平(P＜0.05),表达于干预第10天时达到高峰,随后呈轻度下降趋势.结论 Wnt3a通过激活Wnt/β-catenin信号通路调控人骨髓间充质干细胞成骨分化.
