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鸡源Wnt3a融合蛋白表达载体的构建及其对鸡胚脊髓神经前体细胞增殖和轴突形成的影响
目的 构建鸡源Wnt3a融合蛋白真核表达载体(pCAG-MCs-Wnt3 a-EGFP),并探讨其在鸡胚脊髓发育过程中超表达后对神经前体细胞增殖及轴突形成的影响.方法 利用分子生物学手段,提取鸡胚脊髓总RNA并获得Wnt3a片段,将其克隆到pCAG-MCs-EGFP载体中构建pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP表达载体.在鸡胚发育至2.5～3d (E2.5～E3)时,利用鸡胚活体电转技术将pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP(实验组)和pCAG-MCs-EGFP(对照组)质粒分别转入鸡胚脊髓,E4时取材切片,每组5个胚胎组织,采用免疫荧光染色技术检测Wnt3a和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达变化分析Wnt3a与细胞增殖间的关系,根据载体自发绿色荧光蛋白(GFP)观察脊髓神经前体细胞轴突生成情况.结果 pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP表达载体基因测序结果与Gene bank中基因序列一致,将pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP入鸡胚脊髓中发现绿色荧光.在脊髓组织切片水平上,免疫荧光染色结果表明,Wnt3a在鸡胚脊髓中能够超表达.Wnt3a超表达后,与对照组比较,含有轴突的神经元数量明显减少(n=3,P＜0.01),而PCNA的表达量显著增加(n=3,P＜0.01).结论 成功构建了鸡源性Wnt3a融合蛋白真核表达载体,并证实Wnt3a在鸡胚发育过程中促进神经前体细胞的增殖并抑制轴突的形成.
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硫氧还蛋白TXN对视神经轴突损伤的保护作用
目的 研究硫氧还蛋白(thioredoxin,TXN)在视神经轴突保护中的作用,为视神经损伤提供有效的治疗方案.方法 制作大鼠视神经夹伤模型,以正常大鼠作为正常对照组.按夹伤后处死时间不同,选取伤后1周、2周、4周三个时间点,提取实验组和正常对照组中大鼠视网膜的mRNA和蛋白,通过RT-PCR和Western blot实验方法检测TXN表达情况;用曲古抑菌素A(TSA)刺激RGC-5细胞,观察在TSA刺激后,RGC-5细胞的轴突形成情况,并检测TXN表达量的变化.构建TXN的真核表达质粒,转染进RGC-5细胞,在TNF-α刺激条件下,观察RGC-5细胞的轴突形成情况以及轴突长度的改变.结果 与正常大鼠比较,视神经夹伤模型大鼠中TXN的mRNA以及蛋白水平明显下降.在伤后1周,TXN mRNA表达量仅下降了32％,而在伤后2周、4周则分别下降了55％以及70％,说明TXN表达水平的降低是随着夹伤后时间的延长而增加的.用TSA诱导RGC-5细胞24 h,观察到RGC-5细胞形态发生明显改变,约65％的细胞分化产生轴突,而对照组(DMSO处理)中细胞没有形成轴突,同时Western blot结果显示,相对于DMSO处理,TSA刺激后TXN的表达明显升高.在TNF-α刺激下,RGC-5细胞的轴突形成比率从(65±5)％减少至(30±4)％,轴突长度从(100±6) μm下降至(74±6)μm.而在过表达TXN情况下,TNF-α刺激RGC-5细胞,轴突形成比率为(52±7)％,轴突的长度为(92±8) μm,较未刺激细胞仅有较少的降低.结论 在轴突发生损伤后,TXN的表达量显著下降.而在轴突形成过程中,TXN的表达量明显上升并且过表达TXN能很好地减轻外界刺激诱导的轴突损伤.TXN可能参与了轴突形成并且能有效地防止轴突的损伤.
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极性蛋白与中枢神经系统发育
哺乳动物大脑神经元的形态多样性和突触连接的复杂性是极性细胞的典型例子,形成和维持神经元极性依赖多种极性蛋白的调节.从线虫受精卵发育到哺乳动物神经细胞的极性化通路中,许多极性蛋白存在进化保守机制.中枢神经系统发育的整个过程(包括神经元发生与移行、神经突生长以及突触联系的形成等)都有极性蛋白的直接或间接参与,是各种极性蛋白相互作用/相互制约的动态过程.
