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膳食钙对饮水型氟暴露致子代肝脏损伤的干预作用
目的 探讨膳食钙对氟暴露致子代肝脏损伤的分子机制.方法 取初断乳SD大鼠雌鼠100只,雄鼠50只.雌鼠随机分成对照、染氟、低钙、低钙染氟、高钙染氟5组.3个月后合笼,取14和28日龄仔鼠进行相关实验.结果 与对照组相比,其他各组仔鼠肝细胞的凋亡数量明显增多,28日龄仔鼠低钙染氟组Bcl-2蛋白表达降低(P＜0.05),染氟组和低钙染氟组14日龄雄性、28日龄雌雄仔鼠肝组织Caspase12蛋白表达水平升高(P＜0.01);与染氟组相比,低钙染氟组的细胞凋亡数量明显增多,高钙染氟组的细胞凋亡数量有所下降,各日龄仔鼠低钙染氟组Bcl-2蛋白表达降低(P＜0.05),28日龄雄性仔鼠高钙染氟组Caspase12蛋白表达降低(P＜0.05),低钙组降低(P＜0.01).结论 氟中毒致子代肝损伤的机制可能是氟暴露导致子代肝组织上调内质网途径凋亡通路中Caspase12表达,下调Bcl-2的表达,低钙与染氟表现出协同作用,高钙则能缓解氟中毒症状.
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芪卫颗粒含药血清通过Caspase12途径减轻高糖环境下肾足细胞损伤的机制研究
目的:观察芪卫颗粒(QWG)含药血清对高糖环境下肾足细胞Caspase12凋亡途径的影响,探讨其保护足细胞损伤的作用机制.方法:将体外培养的条件永生系小鼠足细胞分为正常组,甘露醇组,模型组,QWG高、中、低浓度组.干预24h后,罗丹明-鬼笔环肽染色观察足细胞骨架结构;CCK8法、Annexin V-FITC/PI双染色法检测高糖环境下足细胞活力及凋亡情况;免疫细胞化学检测Caspase12及GRP78蛋白表达变化,Western blot检测足细胞标志蛋白Nephrin水平.结果:QWG含药血清能够增加高糖环境下足细胞活力(P＜0.05,P＜0.01),减少细胞凋亡,改善足细胞骨架结构,增加Nephrin表达(P＜0.05),同时降低高糖环境下足细胞内质网应激GRP78及Caspase12蛋白水平(P＜0.05,P＜0.01). 结论:芪卫颗粒含药血清能够保护高糖环境下足细胞损伤,与内质网应激介导的Caspase12凋亡途径相关.
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Grp78和caspase-12在缺氧心肌细胞中的表达
目的 利用体外培养的心肌细胞缺氧模型,观察不同缺氧时间点Grp78和caspase-12在心肌细胞中的表达变化.方法 将原代培养的大鼠心肌细胞,随机分为正常对照组,缺氧0.25h、0.5h、1h、1.5h、2h、4h、8h、12h、16h、24h组,通过TUNEL法检测缺氧心肌细胞凋亡,应用Western blot法检测不同缺氧时间点Grp78和caspase-12在心肌细胞中的表达.结果 与对照组相比,缺氧组细胞凋亡指数随缺氧时间延长逐渐升高;Grp78蛋白于缺氧0.25h开始表达,缺氧1h达到峰值;procaspase-12于缺氧0.5h表达开始增高,2h达到峰值;caspase-12于缺氧1h表达上升,4h达到峰值.结论 缺氧激活了内质网应激反应,可引起心肌细胞凋亡.
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Caspase12在糖尿病大鼠逼尿肌细胞内质网应激中的表达
目的 探讨Caspase12在糖尿病大鼠逼尿肌细胞内质网应激中的表达及作用.方法 在不同的时间点(4、8、12、16周后诱导1型糖尿病大鼠模型),通过注射链脲菌素诱导糖尿病大鼠模型.在电镜下观察内质网形态,应用TUNEL技术检测糖尿病大鼠膀胱逼尿肌细胞的凋亡水平,采用RT-PCR技术测定逼尿肌细胞内Caspase12mRNA的表达水平,采用Western-blot技术检测逼尿肌细胞内的Caspase12蛋白表达水平.结果 电镜下内质网呈不规则改变,膜表面附着大量核糖体;逼尿肌细胞凋亡水平随着时间延长呈显著升高趋势;Caspase 12的mRNA和蛋白水平曲线随病理过程的延长而增加.结论 Caspase12参与糖尿病大鼠逼尿肌平滑肌细胞的内质网应激.
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钙对母鼠氟暴露致仔鼠海马神经细胞凋亡的影响及分子机制
目的 探讨不同饲料钙水平对母鼠氟暴露致仔鼠海马神经细胞凋亡的影响及分子机制.方法 选用SD大鼠100只,75只雌鼠随机分为对照组(Con)、高氟组(F)、低钙组(LCa)、高氟低钙组(F+LCa)和高氟高钙组(F+HCa),饲养3月后,雌雄鼠合笼交配产仔鼠,取14、28日龄仔鼠2批,以海马CA3区神经细胞凋亡及凋亡信号通路相关蛋白Bcl-2、Caspasel2和JNK表达水平为观测指标.结果 母鼠氟暴露后,28日龄雌雄海马细胞凋亡指数显著(P＜0.05)升高;14、28日龄雌雄仔鼠海马凋亡信号通路中Bcl-2蛋白表达均呈现极显著(P＜0.01)下调,而14日龄雄仔鼠和28日龄雌仔鼠的Caspase 12、14和28日龄雌雄仔鼠JNK蛋白表达水平均呈极显著(P＜0.01)上调,14日龄雌仔鼠和28日龄雄仔鼠的Caspasel2仅呈显著(P＜0.05)上调;饲料低钙加剧母鼠氟暴露后仔鼠海马神经细胞凋亡,Bcl-2蛋白表达水平进一步下降,Caspasel2和JNK蛋白表达水平进一步上升;而饲料高钙能够缓解母鼠氟暴露致仔鼠海马神经细胞的凋亡,逆转上述3者的蛋白表达水平;所检测的上述3个凋亡相关蛋白中,只有Caspasel2表达水平呈性别和日龄差异,饲料钙对母鼠氟暴露致14日龄雄仔鼠和28日龄雌仔鼠Caspase 12表达水平变化分别较同一日龄另一性别仔鼠的影响更大.结论 海马凋亡信号通路中Bcl-2、Caspasel2和JNK蛋白表达水平的变化可能是钙对母鼠氟暴露致子代大鼠大脑神经细胞凋亡影响的分子机制之一.饲料钙对母鼠氟暴露致14、28日龄仔鼠海马凋亡信号通路Caspase 12表达水平变化的影响呈一定的性别差异,其机制有待于进一步阐明.
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内质网应激及介导细胞凋亡信号转导研究进展
近年来,内质网应激(ERS)和它所诱导的细胞凋亡被认为在慢性疾病、神经退行性疾病、癌症和糖尿病等疾病的病理生理中发挥重要作用.当内质网(ER)正常功能紊乱时,会扰乱细胞内环境,引起ERS,从而激活一系列进化保守的自我保护性信号通路统称为未折叠蛋白质反应(UPR).初,UPR旨在恢复ER内部平衡,保护细胞存活,但如果这些尝试失败,UPR将转而激活凋亡级联反应,导致细胞凋亡.文章对ERS反应进行介绍,综述了ERS激活跨膜蛋白激酶(IRE1)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、活化转录因子6(ATF6)介导的促存活通路及ERS介导的包括增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、半胱天冬氨酸蛋白12(Caspase12)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等促细胞凋亡途径的可能机制.
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未折叠蛋白反应参与小鼠急性肾缺血/再灌注损伤
目的 探讨未折叠蛋白反应(UPR)在小鼠急性肾缺血/再灌注损伤中的作用.方法 将C5786小鼠分为正常、假手术组和0、4、12、24 h手术组(分别于术后0、4、12和24 h处死小鼠),留取各组小鼠的左侧肾脏.苏木精一伊红(H-E)、过碘酸雪夫反应(PAS)和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)染色观察各组肾脏组织学变化,Western印迹法和实时聚合酶链反应(PCR)检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和caspasel2在各组小鼠肾组织中的表达.结果 H-E、PAS染色可见24 h手术组的肾小管上皮细胞坏死明显,病变重的部位为外髓外带近端小管,肾小管坏死评分为(2.930 0±0.131 1)分,显著高于其他组(P值均<0.01).TUNEL染色可见24 h手术组的肾小管上皮细胞凋亡指数为(36.17±7.53)%,显著高于其他各组(P值均<0.01).Western印迹法.结果 显示,12 h手术组的GRP78和caspase12蛋白水平显著高于其他各组(P值均<0.01).实时PCR.结果 显示,4 h手术组的GRP78和caspasel2 mRNA水平显著高于其他各组(P值分别<0.01、0.05).结论 在夹闭左侧肾动脉致急性肾缺血/再灌注损伤模型中,小鼠左侧肾脏组织学损伤显示再灌注后24 h严重.GRP78和caspasel2在再灌注后其mRNA和蛋白表达水平明显升高或激活,其变化早于组织学改变.提示UPR可能在急性肾缺血/再灌注损伤中发挥重要作用.
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深低温处理脊髓缺血再灌注后Caspase12的表达情况
目的:观察深低温对大鼠脊髓缺血再灌注的保护作用及对Caspase12表达的影响,初步探讨其可能的作用机制.方法:将45只SD大鼠随机分为3组:深低温18 ℃处理组(A组);常温手术对照组(B组);常温假手术组(C组).每组分为6 h、24 h、1周三个不同时间点取L2～L5段的脊髓,每个时间点5只大鼠,采用普通病理HE染色、Nissl染色、电镜从形态学上观察脊髓组织,免疫组化检测和RT-qPCR检测缺血再灌注后脊髓组织Caspase12蛋白和mRNA的表达变化.结果:组织形态学观察A、B组病理改变均较C组严重,且A组比B组轻,病理学累积评分A、C组明显低于B组(P ＜ 0.01);免疫组化检测和RT-qPCR检测结果分别显示,Caspase12蛋白和mRNA在A、B组各时间段均高于C组,且A组升高程度比B组低(P ＜ 0.05).结论:深低温对大鼠脊髓缺血再灌注有保护作用,并且可能通过抑制Caspase12的表达而发挥其保护作用.
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IGF-1R基因沉默对L02细胞过氧化损伤时Caspase12表达的影响
目的：成功构建稳定沉默表达IGF-1R基因质粒，并转染至L02细胞（人正常肝细胞），观察 IGF-1R基因沉默对L02细胞过氧化损伤时经内质网途径特异性凋亡蛋白Caspase12表达的影响。方法：构建针对 L02细胞 IGF-1R 基因的短发夹状 RNA （shRNA），将4种不同序列的 Sh-H-IGF1R-1108、Sh-H-IGF1R-2797、Sh-H-IGF1R-3215、Sh-H-IGF1R-3787质粒（设为实验组）以及含与IGF-1R无关序列的Sh-H-IGF1R-V1质粒（设为阳性对照组）和空白质粒 Sh-H-IGF1R-V2（设为阴性对照组）分别转染 L02细胞，24 h 后用 RT-PCR 方法检测IGF-1R 表达水平，筛选出稳定沉默IGF-1R基因的质粒。随后进行下一步实验分组：空白对照组（A组）、过氧化损伤组（B组）、阴性质粒转染组（C组）、目的基因转染组（D组）。12 h后收集细胞，采样待测，用Western Blot 法检测各组 Caspase12表达。结果：各实验组与 Sh-H-IGF1R-V1组及 Sh-H-IGF1R-V2组比较扩增倍数均降低（P＜0．05），其中 Sh-H-IGF1R-3215组（0．02±0．01）与Sh-H-IGF1R-3787（0．05±0．05）沉默效果稳定，但后组重复性更好。 B 组（2．41±0．03）、C 组（2．45±0．02）、D 组（3．60±0．06） Caspase12表达均较A组（0．34±0．02）升高（P＜0．01），C组较B 组略升高（P＞0．05），D 组较B、C组显著升高（P＜0．01）。结论：4种针对 IGF-1R 基因沉默质粒均构建成功，并成功转染至人 L02细胞（人正常肝细胞），沉默效果理想的质粒为Sh-H-IGF1R-3787。IGF-1R靶向shRNA质粒可通过沉默L02细胞IGF-1R表达加重细胞凋亡，间接验证了IGF-1/ IGF-1R 信号通路对L02细胞过氧化损伤时经内质网途经的细胞凋亡程序活化有一定的调控作用。
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电针结合脑内注射VEGF修复大鼠脑缺血后再灌注损伤的机制研究
目的 观察电针及电针结合脑内注射血管内皮生长因子(VEGF)对脑缺血后再灌注损伤大鼠caspase12、caspasse3、葡萄糖调节蛋白-78 (GRP78)的影响,探讨电针结合脑内VEGF对脑缺血后再灌注损伤的修复机制.方法 将60只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组、电针+VEGF组,每组15只.后3组采用线栓法进行大脑中动脉缺血(MCAO)法制作脑缺血后再灌注损伤模型.电针组及电针+VEGF组造模后1d开始电针干预(穴位:百会、曲池、足三里),1次/d,每次30 min,共14 d.电针+VEGF组大鼠于造模成功后24 h行第一次电针干预后,向侧脑室内一次性注入10 μL VEGF165 (0.025 μg/μL).每组于0 d(造模后1d,开始电针干预前)、7d、14 d时,各取5只大鼠进行神经功能评分(mNSS)后处死取材,尼氏染色观察脑梗死区组织形态,免疫组化法检测大鼠缺血脑组织GRP78活性,real-time PCR法检测大鼠缺血脑组织caspase12、caspase3、GRP78mRNA表达量.结果0d、7d、14 d时,与假手术组比较,模型组大鼠mNSS评分升高(P＜0.05),镜下可见脑梗死征象(尼氏小体数量明显减少且排列混乱,结构不清晰),GRP78免疫阳性细胞数量增多,GRP78 mRNA表达升高(P＜0.05),caspase12及caspase3 mRNA表达升高(P＜0.05).7d和14 d时,与模型组比较,电针组以及电针+ VEGF组大鼠的mNSS评分降低(P＜0.05),镜下脑梗死征象减轻,GRP78免疫阳性细胞数量增多,GRP78mRNA表达增多(P＜0.05),caspase12、caspase3 mRNA表达降低(P＜0.05),电针+VEGF组上述指标变化均较电针组明显(P＜0.05).假手术组各时点间上述指标差异无统计学意义(P＞0.05),其余3组mNSS评分(P＜0.05)、脑梗死征象、caspase12、caspase3 mRNA表达随治疗时间降低(P＜0.05),GRP78免疫阳性细胞数量随治疗时间增多,GRP78 mRNA表达随治疗时间升高(P＜0.05).结论 电针结合脑内注射VEGF可促进脑缺血损伤组织修复,其机制可能与下调caspase12、caspase3基因,上调GRP78基因的表达有关,且其效果比单纯使用电针法更具优势.
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Caspase12在ERS介导的肝细胞凋亡中的作用
目的:探讨Caspase12在肝纤维化内质网应激(ERS)介导的肝细胞凋亡中的作用.方法:雄性Wistar大鼠40只,随机分为正常对照4周、8周组和肝纤维化模型4周、8周组,每组各10只.肝纤维化组按0.3ml/100g体重的剂量皮下注射40％ CCl4植物油溶液,每隔3天注射一次,造模时间分别为4周和8周;对照组大鼠皮下注射等量植物油溶液.采用TUNEL法检测肝组织中肝细胞凋亡情况;免疫组化检测肝组织中Caspase12蛋白的表达变化;Real-time PCR检测肝组织中Caspase12 mRNA的表达变化.结果:免疫组化及Real-time PCR检测显示肝纤维化4周组大鼠肝组织中Caspase12蛋白及mRNA的表达与正常4周组比较无显著差异;随着肝纤维化程度的加重,肝纤维化8周时大鼠肝组织中Caspase12蛋白及mRNA的表达显著增加;同时TUNEL法检测发现肝纤维化大鼠肝组织中肝细胞凋亡的数目较正常组显著增加.结论:Caspase12可能参与了肝纤维化时ERS介导的肝细胞凋亡过程.
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反式白藜芦醇对Aβ25-35致痴呆大鼠海马caspase12的影响
目的 观察反式白藜芦醇(TR)对β淀粉样蛋白(Aβ25-35)致痴呆大鼠海马caspase12 mRNA和蛋白表达的影响,补充说明TR抗痴呆的作用机制.方法 大鼠随机分为五组:假手术组、阳性对照组、模型组、低剂量组、高剂量组,每组9只.在大鼠海马给予Aβ25-35造模结束后连续灌胃15 d每日1次,阳性对照组给予多奈哌齐1mg/kg,低剂量给予TR10mg/kg,高剂量TR40mg/kg,假手术组和模型组给予同体积的生理盐水.第15天时处死大鼠,免疫组化及Western blot检测海马caspase12蛋白表达,实时定量PCR检测海马caspase12 mRNA的表达.结果 大鼠注射Aβ25-35后,模型组海马caspase12蛋白和mRNA表达明显高于假手术组(P＜0.01).TR剂量依赖性地降低了大鼠caspase12蛋白表达和mRNA表达(P＜0.05).结论 TR抗Aβ25-35致痴呆大鼠的作用机制与抑制海马caspase12基因表达有关.
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丹参预处理对肝脏缺血再灌注损伤后磷酸化真核生物翻译起始因子2α和caspase12的影响
目的 观察丹参预处理对肝脏缺血再灌注损伤后磷酸化真核生物翻译起始因子2α(p-eIF-2α)和caspasel2表达的影响.方法 将80只Wistar大鼠按随机数字表法分成正常对照组5只,假手术组、缺血再灌注组和丹参预处理组各25只,后3组大鼠再根据缺血再灌注时限(0、3、12、24和72 h)分为5个亚组,每组5只.采用动脉夹钳夹肝蒂45 min后,使血液复流的方法制备大鼠缺血再灌注损伤模型.正常对照组大鼠不做处理；假手术组仅解剖肝门不钳夹肝蒂；丹参预处理组大鼠在肝血流阻断前30 min经尾静脉注入丹参注射液6 ml/kg；假手术组和缺血再灌注组大鼠则在肝血流阻断前30 min经尾静脉注入等量生理盐水.采用Western blot检测各组大鼠肝组织中p-eIF-20和caspase12蛋白的表达,HE染色观察各组大鼠同期肝组织的病理形态学变化.多组间比较采用单因素方差分析,组间比较方差齐采用LSD法,方差不齐采用Games-Howell法.结果 正常对照组大鼠肝组织中p-eIF-2α蛋白的相对表达量为0.296±0.038,假手术组在缺血再灌注0、3、12、24和72 h分别为0.304±0.048、0.298±0.038、0.272±0.042、0.266±0.076和0.296±0.043,两组比较,差异无统计学意(P＞0.05).缺血再灌注组大鼠肝组织中p-eIF-2α蛋白的相对表达量在缺血再灌注0h为0.310±0.034,与正常对照组和假手术组同时相点比较,差异无统计学意义(F=0.15,P＞0.05)；在缺血再灌注3、12、24 h,p-eIF-2α蛋白的相对表达量分别为0.386±0.021、0.710±0.034和0.474 ±0.017,与正常对照组和假手术组同时相点比较,差异有统计学意义(F=11.90,211.52,25.15,P＜0.05)；至缺血再灌注72 h,p-eIF-2α蛋白的相对表达量为0.336±0.043,基本回落至正常对照组和假手术组同时相点水平(F=1.57,P＞0.05).丹参预处理组大鼠肝组织中p-eIF-2α蛋白的相对表达量在缺血再灌注0、12、24和72 h分别为0.278 ±0.044、0.800±0.079、1.056±0.125、0.736±0.087和0.442 ±0.047,丹参预处理组在缺血再灌注3、12、24、72 h明显高于缺血再灌注组同时相点水平(P＜0.05).正常对照组大鼠肝组织中caspase12蛋白的相对表达量为0.983±0.003,假手术组在缺血再灌注0、3、12、24和72 h分别为0.974±0.004、0.983±0.005、0.985±0.003、0.981±0.004和0.978±0.004,两组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).缺血再灌注组大鼠肝组织中caspase12蛋白的相对表达量在缺血再灌注0h开始上升为1.018 ±0.076,但与正常对照组和假手术组同时相点比较,差异无统计学意义(F=1.43,P＞0.05)；在缺血再灌注3h明显升高为2.056±0.067,12h达到峰值为2.804±0.050,24 h仍处于相对高水平为1.882 ±0.037,72 h有所下降为1.282±0.066,与正常对照组和假手术组同时相点比较,差异均有统计学意义(F=1290.69,6490.84,2898.71,103.61,P＜0.05).丹参预处理组肝组织中caspase12蛋白的相对表达量在缺血再灌注0、3、12、24、72 h分别为0.998±0.056、1.442±0.066、1.990±0.068、1.364±0.056和0.962±0.054,缺血再灌注3、12、24、72 h均明显低于缺血再灌注组同时相点(P＜0.05).病理形态学检测结果显示:正常对照组和假手术组大鼠肝组织肝小叶结构基本完整,肝细胞连续成索,胞核大而圆；肝缺血再灌注组大鼠肝组织可见肝小叶变形,细胞体积变小,细胞核浓缩,部分出现片状坏死；丹参预处理组大鼠肝细胞肿胀,出现轻微的点状坏死.结论 丹参可能通过上调p-eIF-20的水平稳定内质网内环境,减轻经内质网细胞凋亡途径中caspase12的表达,在肝脏缺血再灌注损伤期发挥肝脏保护作用.
