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过表达miR-30a抑制BMP9诱导C2C12细胞的成骨分化
目的 探讨miR-30a在BMP9诱导间充质干细胞C2C12成骨分化中的作用.方法 BMP9条件培养基处理间充质干细胞C2C12诱导成骨分化,用real-time PCR连续检测miR-30家族成员的mRNA.用BMP9条件培养基作用Ad-mmu-miR-30a预处理的C2C12细胞,通过ALP染色和活性检测来反映早期成骨指标ALP的表达、分别在mRNA水平和蛋白水平检测中期成骨指标(OCN)的表达、用钙盐沉积来检测晚期成骨分化,用流式细胞术和MTT检测C2C12细胞的周期与增殖.后探讨miR-30a在BMP9诱导C2C12细胞成骨分化中的作用机制.结果 miR-30家族中,只有miR-30a在BMP9诱导C2C12细胞成骨分化中表达下调,miR-30a过表达后,通过靶基因Runx2使BMP9诱导成骨分化能力减弱,ALP的表达下降(P＜0.05),OCN蛋白水平和mRNA水平也都表达下调(P＜0.05),钙盐沉积受到抑制.结论 miR-30a可以抑制BMP9诱导C2C12细胞的成骨分化.
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BMP9通过ERK5信号通路调控根尖牙乳头干细胞成骨/成牙本质分化
目的 研究骨形成蛋白9(BMP9)是否通过激活ERK5信号通路调控永生化根尖牙乳头干细胞(iSCAP)成骨/成牙本质向分化.方法 首先使用ERK5抑制剂BIX02189作用于BMP9的腺病毒转染iSCAP,采用Western blotting检测ERK5蛋白的磷酸化水平变化;然后通过碱性磷酸酶(ALP)染色、RT?PCR及茜素红染色检测成骨/成牙本质相关基因Runx2、OCN、OPN和DMP1的表达,研究BMP9对iSCAP成骨/成牙本质分化的影响.结果 BMP9可以上调ERK5磷酸化水平,BIX02189干预后ERK5磷酸化下降;ALP染色,RT?PCR检测表达及茜素红染色均发现BMP9可以促进Runx2、OCN、OPN、DMP1阳性表达,而BIX02189则抑制成骨/成牙本质分化.结论 BMP9可以通过激活ERK5信号通路促进根尖牙乳头干细胞成骨/成牙本质分化.
关键词： 永生化根尖牙乳头干细胞 骨形成蛋白9 ERK5 成骨/成牙本质分化 -
转化生长因子-β1促进骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化
目的:探讨转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)成骨分化过程中的作用.方法:应用鼠MSC C3H10T1/2,以重组腺病毒法将BMP9导入,施加TGF-β1处理,建立BMP9联合TGF-β1诱导MSC成骨分化模型.改良SEAP化学发光法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性;茜素红S染色进行钙盐沉积检测;实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Ⅰ a2型胶原(collagen Ⅰ a2,COL Ⅰ a2)、骨桥素(osteopotin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)的mRNA转录表达水平,免疫细胞化学法检测细胞内OPN、OCN表达变化.荧光素酶报告基因法检测信号通路的Smad水平.结果:TGF-β1与BMP9联合处理较BMP9单独处理能更早更多地提高ALP活性和引起钙盐沉积(F处理=18 782.10,P=0.000),持续处理达17 d后不再显示明显差异,TGF-β1单独处理与对照组间无明显差异(F=1.03,P=0.318).TGF-β1与BMP9联合处理较BMP9单独处理可使COL Ⅰ a2、OPN、OCN mRNA转录水平明显增高(COL Ⅰ a2的F处理=250.30,P=0.000; OPN的F处理=795.64,P=0.000; OCN的F处理=206.55,P=0.000),COL Ⅰ a2增高发生较早和显著(F=250.30,P=0.000);细胞内OPN、OCN蛋白阳性表达显著增强.TGF-β1联合BMP9处理能刺激信号通路相应的Smad荧光素报告活性(x2=32.84,P=0.000).结论:在BMP9诱导MSC成骨分化中,联合应用TGF-β1具有促进成骨作用,BMP9与TGF-β1在成骨分化中可能存在互补效应.
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不同剂量TGF-β1在BMP9诱导间充质干细胞成骨分化中的作用
目的 分析联合应用不同剂量TGF-β1对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化过程的影响,寻找佳的促进BMP9成骨的TGF-β1剂量,为联合不同细胞因子促进组织工程骨再生寻找有效途径.方法 应用鼠间充质干细胞株C3H10T1/2,以重组腺病毒法将其导入BMP9,再分别施加0、5、10、20 ng/mL TGF-β1蛋白处理,建立BMP9联合TGF-β1诱导间充质干细胞成骨分化模型.条件培养基法获取含活性良好的TGF-β1蛋白上清液;改良SEAP化学发光法和组织化学染色法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表达及活性;茜素红S染色检测钙盐沉积;实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测成骨相关基因Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ,COL Ⅰ)、骨桥素(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)的mRNA转录表达水平和蛋白表达水平改变;流式细胞仪检测细胞周期;台盼蓝拒染法计数活细胞监测细胞增殖.结果 5 ng/mL TGF-β1与BMP9联合处理较BMP9单独处理能更早、更多地提高ALP活性和引起钙盐沉积,持续处理17 d后钙盐沉积结果不再显示明显差异,TGF-β1单独处理与对照组间无明显差异.随TGF-β1剂量增加,ALP活性和钙盐沉积效应受到抑制.5 ng/mL TGF-β1与BMP9联合处理较BMP9单独处理使COL Ⅰ、OPN、OCN的mRNA转录水平和蛋白表达水平明显增高,COL Ⅰ增高变化发生较早和显著;TGF-β1应用剂量达到20 ng/mL出现基因转录和蛋白表达受到抑制,但COL Ⅰ升高趋势仍能维持.BMP9促进细胞增殖,TGF-β1对该效应起抑制作用,细胞周期转化表现G0/G1期阻滞.结论 在BMP9诱导间充质干细胞成骨分化中,适量的TGF-β1联合应用具有促进作用;BMP9与TGF-β1在诱导成骨分化中可能存在协同作用关系.
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Smad信号通路在骨形成蛋白9促进牙囊干细胞成骨向分化中的研究
目的 探索骨形成蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)在诱导大鼠牙囊干细胞(rat dental follicle stem cells,rDFCs)成骨向分化过程中的Smad信号通路调控机制.方法 重组腺病毒骨形成蛋白9 (recombinant adenoviruses expressing BMP9,Ad-BMP9)转染纯化的第3代rDFCs后,Realtime qPCR、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及活性检测观察BMP9调节rDFCs早期及中晚期成骨能力,茜素红S染色检测钙盐沉积,Western blot检测Smad1/5/8磷酸化水平.结果 BMP9促进rDFCs成骨因子表达:成骨转录因子Runx2、成骨细胞特异性转录因子Osterix、ALP及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)在BMP9刺激组较空白组均明显升高(P＜0.05),钙盐沉积及钙结节形成也明显多于空白组,且BMP9促进了Smad1/5/8蛋白磷酸化水平升高.结论 BMP9通过激活Smad信号通路,提高Smad1/5/8蛋白磷酸化水平从而促进早中晚期成骨因子及碱性磷酸酶表达,促进了rDFCs成骨向分化.
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β联蛋白参与骨形成蛋白9诱导的C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化
目的 探讨骨形成蛋白9(BMP9)诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化过程β联蛋白(β-catenin)的作用.方法 利用重组腺病毒BMP9(Ad-BMP9)诱导C3H10T1/2细胞分化,通过Western blot法检测Ad-BMP9及不同剂量XAV-939处理后β-catenin的激活情况;在完全抑制β-catenin的情况下,Ad-BMF9诱导l周,通过实时定量PCR法检测心肌细胞增强因子2C(MEF2C)、心肌组织特异性转录因子GATA结合蛋白4(GATA4);Ad-BMP9处理3周后,通过Western blot法及免疫荧光技术检测心肌连接子蛋白43(Cx43)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达.结果 在感染效率约50％的情况下,BMP9可过度激活β-catenin,使其磷酸化水平增高;在XAV-939抑制β-catenin后,Ad-BMP9诱导的C3H10T1/2细胞表达的cTnT、GATA4、Cx43和MEF2C均受到抑制.结论 β-catenin能被BMP9激活并参与BMP9诱导的C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化.
