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带有CMV、CEA误启动子的腺病毒载体介导TK基因在肿瘤细胞中的表达特性
TK基因-GCV系统是有希望在临床上用于肿瘤基因治疗的方法之一.为了提高基因靶向表达的效率,使之可以应用于体内实验,我们构建重组腺病毒AdCMVTK和带有CMV、CEA两个启动子的AdCMVCEATK,在五种癌细胞中进行了体外实验.发现腺病毒介导的TK基因赋予癌细胞GCV敏感性比对照组高2～3个数量级,并使感染病毒和未感染病毒细胞比例为1:10时仍产生较强的"旁观效应".实验表明PG肺癌,CAE结肠癌,HeLa细胞是腺病毒介导的TK基因的理想靶细胞.
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靶向重组腺病毒介导Hsp70基因表达对大鼠胰腺癌移植瘤的抑制作用
目的:观察重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70介导的Hsp70基因表达对大鼠胰腺癌移植瘤生长的影响,并分析其相关机制.方法:建立大鼠胰腺癌皮下移植瘤模型,随机分为3组,分别给予Ad5-pCEA-Hsp70、Ad5-control以及PBS进行治疗.对比不同时间点3组肿瘤大小,评价抑瘤效果:通过ELISA的方法检测外周血Hsp70蛋白含量及细胞因子INF-γ、TNF-α、IL-6的含量;取动物的移植瘤常规HE染色,观察淋巴细胞浸润情况;分离动物脾脏单核细胞,通过流式细胞仪检测CD83+细胞比例,并观察脾淋巴细胞对体外培养的大鼠胰腺癌细胞的杀伤能力.结果:治疗后第4、6、8周,Ad5-pCEA-Hsp70组肿瘤体积分别与Ad5-control组及PBS组相比(724.4 mm3±81.6 mm3 vs 901.3 mm3±103.9mm3、987.5 mm3±126.0 mm3; 681.3mm3±64.9 mm3 vs 1270.6 mm3±131.6 mm3、1398.5 mm3±193.0 mm3; 648.0 mm3±65.9mm3 vs 1487.0 mm3±243.0 mm3、1660.0mm3±167.0 mm3),差异均具有统计学意义(均P＜0.01).Ad5-pCEA-Hsp70组动物外周血Hsp70蛋白及细胞因子INF-γ、TNF-α、IL-6的含量均显著高于Ad5-control组和PBS组(均P＜0.01).HE染色发现,与Ad5-control组和PBS组相比,Ad5-pCEA-Hsp70组有较多的淋巴细胞浸润.经流式细胞仪检测,Ad5-pCEA-Hsp70组脾单核细胞中CD83+细胞比例显著高于Ad5-control组及PBS组(10.8±1.3％ vs5.1±0.6％、4.8±0.6％;均P＜0.01).脾淋巴细胞介导的CTL实验中,当效靶细胞比为1:1时,3组动物之间并无统计学差异(P＜0.05),但随着效靶细胞比的增加,Ad5-pCEA-Hsp70组对胰腺癌细胞的杀伤能力较Ad5-control组和PBS组明显增加(P＜0.05,P＜0.01).结论:重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70介导的Hsp70基因表达对大鼠胰腺癌动物模型的肿瘤生长具有抑制作用,其机制与促进树突状细胞(dendritic cells,DC)的成熟、诱导细胞因子INF-γ、TNF-α、IL-6的分泌、促进淋巴细胞浸润有关.
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CEA启动子驱动下表达Hsp70基因的重组腺病毒的构建及鉴定
目的 构建癌胚抗原(CEA)启动子驱动下靶向表达热休克蛋白70 (Hsp70)基因的重组腺病毒。方法 通过RT-PCR和PCR的方法分别扩增人Hsp70基因和CEA启动子，构建穿梭质粒pDC316-pCEA-Hsp70。将所得的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞获得重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70。通过梯度离心纯化病毒，采用半数细胞培养物感染量测定病毒滴度。分别以重组的腺病毒感染CEA阳性的人胰腺癌BxPC3细胞和CEA阴性的SW1990细胞，通过RT-PCR和ELISA法检测Hsp70 mRNA和蛋白的表达。结果 酶切和测序证实Hsp70基因和CEA启动子成功插入PDC316质粒。与骨架质粒共转染293细胞获得的病毒经PCR扩增证实重组腺病毒构建成功。终获得的病毒颗粒数达2.2 ×1011 vp/ml，滴度为1.5×1010 PFU/ml。重组腺病毒感染CEA阳性表达的BxPC3细胞后，可显著增加Hsp70 mRNA和蛋白的表达，而感染CEA阴性的SW1990细胞，Hsp70 mRNA和蛋白的表达无变化。结论 成功构建了能够在CEA阳性细胞中靶向表达Hsp70基因的重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70，为进一步研究奠定了基础。
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阳离子脂质体介导pE-CEA-cd-tk对CEA阳性肺癌的杀伤作用
目的增强E.coli cd/HSV-1 tk自杀基因的细胞毒性,实现阳离子脂质体介导pE-CEA-cd-tk/5-FC+GCV体系靶向杀伤CEA阳性肺癌.方法 PCR法分别扩增出CMV增强子,CEA启动子,cd-tk,构建真核表达载体pE-CEA-cd-tk;MTT法检测pE-CEA-cd-tk/5-FC+GCV体系的体外细胞毒性.体内实验采用肺腺癌细胞SPC-A-1裸鼠皮下移植瘤模型.通过肿瘤局部或鼠尾静脉注射脂质体/pE-CEA-cd-tk复合物,腹腔注射GCV+5-FC前体药物进行治疗.结果阳离子脂质体介导pE-CEA-cd-tk/5-FC+GCV体系体外可靶向杀伤CEA阳性肺癌细胞,这种杀伤作用存在显著的细胞差异;体内可抑制小鼠皮下肺肿瘤结节的生长,荷瘤鼠存活期延长.结论阳离子脂质体介导pE-CEA-cd-tk/5-FC+GCV体系体内外对CEA阳性肺癌均具有较强的杀伤作用.有望用于CEA阳性肺癌的治疗.
