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HCV核心蛋白抑制SFRP1基因启动子活性
目的 探讨HCV核心蛋白对Wnt信号通路抑制分子SFRP1启动子活性的影响.方法 以人肝癌细胞系Huh7基因组为模板,扩增SFRP1启动子区不同片段(-407～-27bp,-837～-27 bp,-1 202～-27bp,-1 619～-27 bp,-2 029～-27 bp),以pGL3-Basic为载体分别构建SFRP1启动子区截短报告质粒.将构建好的质粒与pRL-TK共转染HEK293细胞,确定启动子区活性强区域；分别用编码HCV核心蛋白的腺病毒或GFP对照腺病毒感染已转染重组报告质粒的SK-Hep1细胞,观察AdCore对SFRP1启动子活性的调控作用.结果 SFRP1启动子区域-407～-27 bp片段活性强；与pGL3-Basic对照组相比较,相对荧光素酶活性增加了37.31 ±4.45倍(P＜0.01),pGL3-S2～S5的活性分别增加了28.74±2.47、13.56 ±2.52、12.97±0.87和8.29±0.09倍(P＜0.01)；HCV Core蛋白能够抑制SFRP1基因启动子区活性,其对pGL3-S1的抑制作用强,与GFP对照组相比较,抑制率为63.8％ ±1.0％ (P＜0.01).结论 HCV核心蛋白通过抑制SFRP1启动子区活性下调SFRP1基因的表达,可能参与Wnt/β-catenin信号通路的活化,并与原发性肝癌的发生密切相关.
关键词： SFRP1 启动子 荧光素酶报告基因载体 HCV核心蛋白 -
NFKBIA 3'UTR不同基因型载体的构建及其功能差异性比较
验证NFKBIA基因3'非翻译区(3'UTR)两个SNP--rs8904C＞T和rs696G＞A的功能.以两个位点分别为CC纯合子和GA杂合子基因型的人全基因组DNA为模板,通过设计不同引物以扩增长度为503 bp的NFKBIA基因3'UTR片段,经测序验证后将该片段克隆至荧光素酶载体pGL3-promoter中,构建4种重组质粒pGL3-rs8904C/rs696G、pGL3-rs8904C/rs696A、pGL3-rs8904T/rs696G和pGL3-rs8904T/rs696A,并转染LS 174T细胞,检测荧光素酶活性.与转染了pGL3-vector组(阴性对照)相比,转染重组双荧光素酶报告质粒的荧光素酶活性均显著下降(P＜0.001).对于rs696G＞A,含等位基因A的两种重组质粒pGL3-rs8904C/rs696A和pGL3-rs8904T/rs696A的荧光素酶活性分别比含等位基因G的两种重组质粒pGL3-rs8904C/rs696G和pGL3-rs8904T/rs696G下降约45.1％ (P＜0.05)和56.1％ (P＜0.001).对于rs8904C＞T,含等位基因T的两种重组质粒分别与含等位基因C的两种重组质粒相比,荧光素酶活性无显著性差异.NFKBIA基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功,并发现rs696G＞A会减弱荧光素酶活性的表达,rs8904C＞T对荧光素酶活性的表达无明显影响.
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速激肽受体1基因启动子近端E盒点突变对下游基因调控的影响
目的 研究NK1R转录起始位点上游启动子近端E盒点突变对下游基因转录活性的影响.方法 定位NK1R基因转录起始点上游近端E盒结构,克隆含近端E盒的启动子序列,对E盒进行点突变,构建野生型和突变型荧光素酶报告基因载体,分别与内参荧光素酶报告基因载体pGL4.74 hluc转染MCF-7细胞,根据转染质粒类型分为PGL3野生型组、PGL突变型组、PGL3-basic组.结果 PGL3野生型组NK1R荧光素酶载体相对表达量为0.75±0.05;PGL3突变型组荧光素酶载体NK1R相对表达量0.60±0.07;PGL3-basic组相对表达量为0.38±0.05.结论 E盒结构可以影响所在启动子对下游基因的转录激活作用,点突变可以降低对下游基因的转录活性.
关键词： 速激肽受体1 E盒 启动子 荧光素酶报告基因载体 -
小鼠Daintain/AIF-1基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建
目的:对Daintain/AIF-1(大炎肽/同种异体移植炎症因子-1)基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源.方法:提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA.以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5'端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序.结果:PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1 基因5'端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1(pGL3-Basic-DT)栽体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变.结论:Daintain/AIF-I基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源.
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血管内皮生长因子基因3'UTR不同基因型载体的构建与鉴定
目的:构建含SNP位点的血管内皮生长因子(VEGF)基因YUTR的荧光素酶报告基因载体,为进一步揭示VEGF基因3'UTR的单核苷酸多态性(SNP)影响肺癌发病风险的分子机制奠定基础.方法:以rs3025039和rs3025040两个位点均为C纯合子的非癌症病人血液DNA为模板,扩增出两位点为C/C单体型、长度为1448 bp的VEGF基因3'UTR目的片段,测序验证后将其克隆至pMIR-REPORT荧光素酶报告基因载体上,得到重组质粒pMIR-C/C.同时,我们以pMIR-C/C为模板定点突变两个SNP 位点,得到具有T/T单体型的重组质粒pMIR-T/T.将各重组质粒转化大肠杆菌DH10B,筛选阳性克隆后提取质粒进行双酶切鉴定及DNA测序鉴定.结果:单菌落质粒测序验证显示带有C/C单体型的VEGF基因3UTR重组质粒pMIR-C/C构建成功；经两次定点突变,成功将pMIR-C/C质粒转变为pMIR-T/T,经测序验证未引入任何其他突变.同时生物信息学预测还显示rs3025040位点位于miR-199a/b与VEGF基因nRNA的结合位置,其改变可以影响miRNA与mRNA的结合效率.结论:本研究成功构建了含有两个连锁SNP的VEGF基因3'UTR的荧光素酶报告基因载体,为今后VEGF基因3'UTR的功能研究奠定基础.
关键词： VEGF基因 单核苷酸多态性 3'UTR 荧光素酶报告基因载体 -
EphA3基因启动子区域定位表达及活性分析
目的 构建含有不同长度 EphA3 基因启动子片段的报告基因载体,研究其在 293T 细胞和 MEF细胞中的转录活性.方法 以Balb/C小鼠基因组 DNA 为模板,扩增不同长度的 EphA3 基因启动子片段,并克隆进入荧光素酶报告基因质粒 pGL3-Basic 真核表达载体内.酶切鉴定及基因测序无误后,将重组质粒和 pRI-CMV 内对照质粒共转染 293T 和 MEF 细胞,分析不同长度的 EphA3 基因启动子片段的转录活性.结果 酶切和测序鉴定表明表达载体构建成功,EphA3 基因的核心启动子区域位于-279bp～+110 bp之间,在 293T 细胞和 MEF 细胞中其转录活性相似.结论 成功构建了荧光素报告基因重组质粒,并确定了E-phA3 基因的核心启动子区域.
关键词： EphA3基因 启动子 荧光素酶报告基因载体 转录活性
