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我国分离的盖塔病毒衣壳蛋白基因和3'非翻译区分子特征研究
对我国海南省和河北省分离到的3株盖塔病毒(GETV)(M1、HB0215-3和HB0234)进行衣壳蛋白基因和3'UTR区序列测定,并分析比较该病毒的分子生物学遗传特征.首先应用逆转录聚合酶链反应扩增出病毒衣壳蛋白基因和3'UTR片段,纯化后连接到载体中进行测序,然后用Clastal X和DNASTAR软件对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,用MEGA软件绘制系统发生树.3株病毒衣壳蛋白基因分别由801、804和804个核苷酸组成,分别编码267、268和268个氨基酸,3株病毒之间核苷酸和氨基酸序列同源性为97.6%～100%和97.8%～100%,与其他GETV分离株核苷酸同源性在95.4%～99.6%之间.3株病毒3'UTR分别由411、401和401个核苷酸组成,发现中国株存在10个(45～54位)核苷酸缺失和2个(64位、148位)特有的核苷酸位点.进化分析表明盖塔病毒之间的进化关系与分离年代相关,中国境内流行的盖塔病毒是相对独立的一个类群.
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一个遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系F7基因信号肽区L12R和3'非翻译区c11814-insAA复合性突变与表型分析
目的:通过对一个遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症患者家系成员表型与基因型分析,研究其基因突变与临床表型的关系,探讨其分子发病机制.方法:对先证者及其父母进行活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原和FⅦ活性(FⅦ∶C)、FⅦ抗原(FⅦ∶Ag)检测,对其F7基因的全部外显子及侧翼、启动子区进行测序,以寻找致病基因突变.根据信号肽预测数据库构建包含所发现突变的FⅦ蛋白分子模型,进行功能预测,推断其对蛋白合成和功能的影响.结果:先证者APTT正常,PT明显延长(58.3 s),FⅦ:C显著下降(1.1％),FⅦ∶Ag重度降低(0.9％),其父母的APTT、PT、FⅦ:C和FⅦ∶Ag均在正常范围内.先证者和其父亲的F7基因第1a外显子第556位核苷酸发生杂合性T/G突变,导致相应氨基酸由亮氨酸(L)变成精氨酸(R),即L12R.功能预测分析提示,L12R突变影响到信号肽区不同区域的分割及其相应功能,进而导致成熟蛋白质的合成减少和因子活性明显降低.同时,先证者F7基因还存在自发性3'非翻译区c11814-insAA杂合性突变,而其父母均无此突变.结论:发现1例F7基因L12R突变,位于信号肽区的该杂合突变是导致此例遗传性FⅦ缺乏症发生的主要分子基础,而位于3'非翻译区的自发性c11814-insAA突变则进一步造成了FⅦ合成的减低.
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四川省首株盖塔病毒SC1210的鉴定
目的 对四川省从蚊虫分离到的病毒SC1210进行鉴定并分析其基因组特征.方法 利用披膜病毒科甲病毒属特异性引物进行RT-PCR鉴定,并采用二代测序平台Ion Torrent PGM进行基因组全序列测定,然后利用Mega Align软件对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,利用Mega 6软件绘制系统发生树.结果 SC1210为盖塔病毒(Getah virus,GETV),该株病毒基因组全长11 690nt,与国内外其他分离株的核苷酸同源性为99.2％-99.7％,氨基酸同源性为96.5％-99.4％.衣壳蛋白全长为804nt,编码268个氨基酸,与其他株的核苷酸同源性为94.9％-99.2％,氨基酸同源性97％-99.6％.E2基因全长1 266 nt,编码422个氨基酸,与其他株的核苷酸同源性为94.6％-99.6,氨基酸同源性为97.1％-99.5％.3'UTR全长402 nt,具有GETV病毒独特的3个完整的重复序列元件和19 nt的保守序列.结论 四川省分离到的首株GETV SC1210与云南分离株YN0540亲缘关系较近,而与马来西亚原始株MM2021亲缘关系较远.
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我国新分离盖塔病毒的部分基因组分子特征研究
目的 通过分子生物学方法研究我国山东省2008年分离的盖塔病毒(DY0824)基因组分子生物学特征.方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出结构区基因和3' UTR片段,连接到载体中进行序列测定,然后用Clustal X1.83和MegaAlign软件对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,用Mega4软件绘制系统发生树.结果 DY0824病毒株衣壳蛋白由804个核苷酸组成,编码268个氨基酸,与国内外其他分离株的核苷酸同源性为95.4%～99.9%,氨基酸同源性为97.4%～100%.E2蛋白全长1266个核苷酸,编码422个氨基酸,与其他株的核苷酸同源性为94.8%～99.5%,氨基酸同源性为97.6%～100%.该病毒3' UTR由401个核苷酸组成,存在3个重复序列.结论 山东省新分离盖塔病毒衣壳蛋白和E蛋白基国与该病毒原型分离株相比分别存在7个和10个氨基酸差异位点,病毒3'UTR区域存在多个核苷酸差异位点.
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NFKBIA 3'UTR不同基因型载体的构建及其功能差异性比较
验证NFKBIA基因3'非翻译区(3'UTR)两个SNP--rs8904C＞T和rs696G＞A的功能.以两个位点分别为CC纯合子和GA杂合子基因型的人全基因组DNA为模板,通过设计不同引物以扩增长度为503 bp的NFKBIA基因3'UTR片段,经测序验证后将该片段克隆至荧光素酶载体pGL3-promoter中,构建4种重组质粒pGL3-rs8904C/rs696G、pGL3-rs8904C/rs696A、pGL3-rs8904T/rs696G和pGL3-rs8904T/rs696A,并转染LS 174T细胞,检测荧光素酶活性.与转染了pGL3-vector组(阴性对照)相比,转染重组双荧光素酶报告质粒的荧光素酶活性均显著下降(P＜0.001).对于rs696G＞A,含等位基因A的两种重组质粒pGL3-rs8904C/rs696A和pGL3-rs8904T/rs696A的荧光素酶活性分别比含等位基因G的两种重组质粒pGL3-rs8904C/rs696G和pGL3-rs8904T/rs696G下降约45.1％ (P＜0.05)和56.1％ (P＜0.001).对于rs8904C＞T,含等位基因T的两种重组质粒分别与含等位基因C的两种重组质粒相比,荧光素酶活性无显著性差异.NFKBIA基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功,并发现rs696G＞A会减弱荧光素酶活性的表达,rs8904C＞T对荧光素酶活性的表达无明显影响.
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真核生物3'UTR的转录后水平调控及其与肿瘤的关系
真核生物3'非翻译区(3'untranslated regions,3'UTR)在转录后水平调控中起到重要作用,它参与调控mRNA的体内稳定性及降解速率,控制mRNA的利用效率,还决定mRNA的翻译位点及翻译效率,调控mRNA细胞内运输及胞质定位等多种代谢过程.3'UTR既可以与microRNAs或者RNA结合蛋白相互作用来反式调控基因的表达,从而阻止mRNA的翻译或直接降解靶mRNA,同时3'UTR也可以作为独立存在的RNA分子发挥功能,近年来通过对肿瘤全基因组相关研究发现突变发生在3'UTR或与microRNA结合区会破坏细胞内的调控机制,从而影响肿瘤的发生发展,使3'UTR成为目前研究热点,并使其有望成为肿瘤诊断和治疗的新标志物甚至药物靶点.
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microRNAs与消化系肿瘤
微RNA(miRNAs)是一类大小约21～25个核苷酸、非蛋白质编码的小分子RNA,可通过干扰mRNA翻译,下调靶基因表达,从而调控体内许多重要生命活动.近年来研究发现,miRNAs异常参与了多种消化系肿瘤的发生和发展,如食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌等.本文就miRNAs的生物学特性及其在消化系肿瘤中的作用作一综述.
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白细胞介素-12p403'非翻译区基因多态性与丙型肝炎病毒感染的相关性
目的 探讨丙型肝炎患者IL-12p40 3'非翻译区rs3212227位点基因多态性与HCV感染的关系.方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和DNA测序的方法榆测127例丙型肝炎患者IL-12 p40 3'非翻译区rs3212227位点的基因型,采用荧光定量PCR技术测定丙型肝炎患者血清HCV RNA水平.组间基因型及等位基因分布频率比较采用χ2检验.结果 丙型肝炎患者IL-12 p40 3'非翻译区rs3212227位点AA、AC、CC基因型分布频率分别为34.6%、40.9%和24.4%.等位基因A、C分布频率分别为55.1%、44.9%.丙型肝炎患者中HCVRNA≥2.0×106拷贝/mL组IL-12 p40 rs3212227位点C等位基因携带者分布频率明显高于HCVRNA<2.0×106拷贝/mL组(χ2=7.367,P=0.007).IFN无应答组IL-12 p40 rs3212227位点C等位基因分布频率明显高于IFN应答组(χ2=4.942,P=0.026).结论 IL-12p40 3'非翻译区rs3212227位点基因多态性与HCV感染具有相关性,携带C等位基因的个体可能更利于HCV复制,而不利于IFN治疗.
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TBX2基因3'非翻译区位点rs59382073与汉族人群散发型先天性心脏病的易感性密切相关
目的 分析TBX2基因3'UTR变异位点与汉族人群散发型先天性心脏病(CHD)的遗传易感性是否关联,初步探讨其可能的发病机制.方法 纳入2010年8月至2012年4月山东济南军区总医院心血管病研究所诊断的非综合征型汉族CHD为CHD组,以同期医院和社区体检的健康儿童为对照组.选择CHD组和对照组各24例行TBX2 3'UTR测序.根据测序结果在CHD组和对照组分别行SNaPshot基因分型和关联分析;通过细胞转染及荧光素酶检测对阳性位点进行功能分析.结果 CHD组纳入768例,年龄(6.1±4.8)岁,男383例(49.9％);对照组纳入660例,年龄(6.5±3.2)岁,男354例(53.6％).①24例CHD和24例对照行TBX2基因3'UTR区测序发现3个已知的SNPs位点:rs59382073、rs1058004和rs729782,未检出新发SNPs位点.②样本采集中期CHD和对照组各288例样本的关联分析显示,rs59382073的基因型在CHD组和对照组的分布差异有统计学意义(P =0.012);余2个SNPs在两组间差异无统计学意义(P＞0.5),后续样本未行该2个SNPs检测.③全样本关联分析显示,TBX2 3'UTR rs59382073位点与散发型CHD的患病风险密切相关,GT/TT基因型较GG基因型可导致CHD的患病风险增加2.13倍(OR =2.13,95％CI:1.51 ～2.99,P=1.44×10-5);进一步分层分析显示,与GG基因型相比,GT/TT基因型增加2.75倍圆椎动脉干畸形(OR=2.75,95％CI:1.57～4.81,P =3.99×10-4)、3.18倍法洛四联症(OR =3.18,95％CI:1.53 ～ 6.61,P=1.90×10-3)和1.70倍室间隔缺损(OR=1.70,95％CI:1.17～2.46,P=5.14×10-3)的患病风险.④细胞水平的功能研究提示,与G等位基因相比,转染T等位基因可分别导致HEK 293 T及H9C2细胞的荧光素酶活性下降29.2％和33.6％.结论 TBX2 3'UTR rs59382073位点可显著增加汉族人群散发型CHD的患病风险;其不同等位基因的荧光素酶表达水平存在差异,为潜在的功能位点.
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DNA双链断裂修复基因3'UTR的多态性与汉族人年龄相关性白内障的关系
目的 探讨DNA双链断裂修复基因3'非翻译区(3'UTR)的单核苷酸多态性(SNP)与汉族人年龄相关性白内障(ARC)的关系.方法 提取无锡滨湖区和盐城阜宁县ARC患者(ARC组,789例)及正常人(对照组,789例)的全血基因组DNA;采用Taqman荧光探针和实时荧光定量PCR法分析4个双链断裂修复基因3'UTR的4个SNP位点的基因型,比较各位点在两组之间的分布差异并计算相对危险度(OR).结果 XRCC5-rs1051685与ARC、皮质性和混合性ARC密切相关(OR=1.61、2.12和1.89,P＜0.01),RAD52-rs1051669与ARC、皮质性和核性ARC密切相关(OR=0.72、0.69和0.71,P＜0.05).结论 XRCC5、RAD52基因3'UTR的多态性在汉族人ARC的发生、发展中起重要作用,不同亚型的ARC可能具有特异性的危险因素和致病机制.
关键词： 年龄相关性白内障 DNA双链断裂修复基因 3'非翻译区 单核苷酸多态性 -
瘦素基因3'非翻译区对基因表达的调控作用
目的 探讨人类瘦素(hLEP)基因3'非翻译区(3'-UTR)对基因表达的影响,为调控瘦素(LEP)的表达提供分子生物学依据.方法 应用生物信息学软件预测-hLEP基因3'-UTR中潜在的miRNA结合位点;通过基因重组构建含有hLEP基因3'-UTR的荧光素酶报告载体pGL3-LEP,在人肝癌HepG2细胞中通过瞬时转染法观察报告基因的表达变化,并应用化学发光法检测荧光素酶的活性.结果 预测到hLEP基因3'-UTR中含有miR-296的结合位点,通过过表达miR-296观察到含有hLEP 3'-UTR的报告基因表达被抑制,与阴性对照组比较,miR-296使含有hLEP基因3'-UTR片段的报告载体pGL3-LEP荧光素酶的活性下降50%(P<0.05),其荧光素酶活性显著高于不含有该片段的对照载体(P<0.05).结论 hLEP基因3'-UTR参与了LEP的表达调控.
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microRNA与mRNA不同位点结合后的生物学效应研究进展
microRNA(miRNA)是一类单链非编码小RNA,主要参与功能基因的转录后调控,具有广泛、多样的生物功能,在真核生物体内对基因表达具有重要的调控作用.miRNA既可以抑制编码基因mRNA的表达,又可以激活mRNA的作用;既可以在细胞质中作用于mRNA的不同区域,也可以返回细胞核中发挥重要的生物学功能;同一个miRNA不一定只是一种作用模式,它可以同时作用于3'UTR、5'UTR和ORF区域.在细胞质中,miRNA通过与mRNA 3个区域中存在的识别位点互补配对并结合一些辅助蛋白发挥作用;在细胞核中,miRNA通过与lncRNA的相互作用起到调节基因功能的作用;miRNA还可与DNA的启动子序列相结合,诱导基因转录与翻译.
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Exosome的功能及作用机制的研究进展
Exosome(外切酶体)是一种包含了至少10种必要组分的蛋白复合物,它在真核细胞RNA加工和mR-NA 3'→5'方向降解过程中都起重要的作用.近两年来,exosome还被发现在mRNA的质量控制和5'端去帽中起关键作用.随着对mRNA的AREs功能研究的进一步深入和ski复合物的发现,人们对exosome作用机制的认识取得了突破性进展.
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微小RNA-106b靶向下调腺瘤性息肉病基因表达促进Hep-2细胞的增殖
目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-106b影响喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株增殖的分子机制.方法 应用噻唑蓝(MTT)法分析miR-106b对Hep-2细胞株增殖的影响;通过实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和Western blot技术检测miR-106b各转染组腺瘤性息肉病基因(APC) mRNA和蛋白表达水平;将APC基因3'非翻译区(3'UTR)-荧光素酶表达载体及其突变体与miR-106b共转染至Hep-2细胞,采用双荧光素酶检测系统检测荧光素酶的活性.结果 与miR-106b inhibitor和对照组比较,转染miR-106b-mimics能明显促进Hep-2细胞的增殖;APC蛋白在miR-106b-mimics转染组、对照组和miR-106b inhibitor中的表达水平分别为0.586 ±0.023,0.734 ±0.024和0.927±0.018,3组间差异有统计学意义(P＜0.05);而APC mRNA的表达水平在3组间差异无统计学意义(P＞0.05);在共转染野生型APC基因3'UTR-荧光素酶表达载体的Hep-2细胞中,上述3组荧光素酶的活性分别为4.37±1.04,8.376±1.23和23.75±1.63,3组间差异有统计学意义(P＜0.05);而在共转染突变型APC基因3'UTR-荧光素酶表达载体的Hep-2细胞中,上述3组荧光素酶的活性差异无统计学意义(P＞0.05).结论 在喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株中,miR-106b可结合到APC基因3'UTR,在转录后水平负性调控APC基因的表达,从而促进Hep-2细胞的增殖.
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真核生物mRNA 3'非翻译区的调控功能
真核生物mRNA 3'非翻译区可以调节转录本的稳定性、亚细胞定位和翻译水平,决定某一特定mRNA的命运,是许多基因表达所必需的一个调节区.3'非翻译区介导的功能的修饰可影响一个或多个基因的表达,从而导致疾病的发生.对相关mRNA 3'非翻译区的调节序列和与这些序列特异结合的蛋白质等具体信息的认识,将成为药物设计的新的分子靶.
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HSPA5基因3'UTR 区多态性与肝细胞癌的相关性
目的 调查70kDa热休克蛋白5(HSPA5)基因3'非翻译区(UTR)的多态性与HCC发病风险之间的关系.方法 从576例肝细胞癌患者和539例在性别和年龄上匹配的健康对照者外周血中提取DNA,采用TaqMan检测HSPA5基因3'UTR区的rsl6927997、rsll40763和rsl2009.结果 连锁不平衡的分析确定了3种单倍型和6种双倍型.等位基因、基因型、单体型和双体型在肝癌患者和正常对照组之间的分布没有显著差异.结论 本研究表明,HSPA5基因3'UTR的多态性不是有效预测肝细胞癌风险的诊断标志物.
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DNA修复基因RAD52miRNA靶序列单核苷酸多态性与肝细胞癌遗传易感性研究
目的 探讨DNA修复基因RAD52 3'非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)miRNA靶序列单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与广西地区人群肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)遗传易感性的关系.方法 采用病例-对照研究,对1 002例确诊的HCC新发病例和1 013例非肿瘤患者RAD52基因3'-UTR区域miRNA靶序列SNPs(rs1051669、rs1051672、rs7301931和rs7310449)进行基因分型,并分析其基因型频率分布及其与HCC遗传易感性的关系.结果 RAD52基因各SNP基因型在病例组和对照组中的分布频率差异均无统计学意义(P＞0.05).调整年龄、性别、吸烟、饮酒和HBV感染等因素后,未发现各SNP与HCC易感性有关联;分层分析发现,在女性人群中,与携带rs1051669 C等位基因相比,TT基因型可显著降低个体罹患HCC的风险(ITvs CT/CC:OR=0.03,95％CI:0.00～0.62,P=0.03);与携带rs1051672 G等位基因相比,AA基因型可显著降低个体罹患HCC的风险(AA vs GA/GG:OR=0.03,95％CI:0.01～0.88,P=0.04).结论 RAD52基因3'-UTR区域miRNA靶序列SNPs rs1051669、rs1051672位点可能与广西地区女性人群HCC易感性有关.
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雌激素受体β基因3'非翻译区G1730A多态性影响该基因转录活性
目的 研究雌激素受体β(ERβ)基因的3'非翻译区G1730A的单核苷酸多态性(SNP)对ERβ转录活性的影响.方法 采用基因重组和定点突变技术,构建ERβ基因该位点的野生型G及突变型A双荧光素酶报告基因载体,将其转染HEK293细胞和HeLa细胞,分析比较不同基因型载体的相对荧光素酶活性.结果 1730A突变型的荧光素酶相对活性比值,在两种细胞中均高于野生型1730G.结论 ERβ基因G1730A位点的SNP影响ERβ的转录,可能导致其蛋白表达水平的增加.
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SNP芯片联合质谱筛检胃癌相关基因3'UTR区SNPs的病例-对照研究
目的:探讨胃癌发生相关基因3'非翻译区(3'UTR)单核苷酸多态性位点(SNPs),为寻找有价值的胃癌分子标志物提供新的依据.方法:采用1∶1配对病例-对照研究的方法.应用SNP芯片对福建省胃癌高发区仙游县96例胃腺癌患者与96例健康对照人群基因组中消化道肿瘤相关基因3'UTR区SNPs位点进行检测,应用飞行时间质谱分析质谱技术对芯片筛检出来的SNPs位点在622例胃癌患者和622例正常健康基因组中进行验证.结果:SNP芯片及生物信息学分析选取EGFR rs884225、EGFR rs10277413、FASra1468063、MSH2 rs 17502941和MSH2 rs11125144为候选基因位点.对622对病例-对照组样本的上述候选基因位点进行SNP分型,均未发现上述5个位点与胃癌易感性相关.进一步分层分析结果发现EGFR rs884225中含有T等位基因的基因型(CT+TT)与贲门癌相关(OR=0.67,95％CI:0.46～0.99),而其他位点与贲门癌、非贲门癌的风险关联无统计学意义(P＞0.05).结论:EGFR基因3'非翻译区的rs884225多态性位点与福建省仙游县的贲门癌发生存在关联,T等位基因可能是贲门癌发生的一个遗传保护因素.
