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Ano2是钙激活氯离子通道的分子基础
目的 探讨Ano2是否为钙激活氯离子通道的分子基础.方法 用RT-PCR技术扩增Ano2编码基因,将Ano2连接到真核表达载体pEGFP-N3;通过脂质体介导将Ano2转染至FRT细胞,抗生素筛选获得稳定表达Ano2的细胞系;倒置荧光显微镜下观察Ano2在FRT细胞中的表达和分布,Western blot检测Ano2的表达;全细胞膜片钳技术研究Ano2的电生理学特性.结果 成功构建pEGFP-Ano2真核表达载体;Ano2表达在FRT细胞膜上;Ano2电流呈Ca2+、时间和电压依赖性,电流和电压关系呈外向整流.结论 Ano2是钙激活氯离子通道的分子基础.
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钙激活氯离子通道对大鼠肺动脉张力的调节作用
目的:研究钙激活氯离子通道及其通道阻断剂尼氟灭酸(niflumic acid,NFA)、indaryloxyacetic acid(IAA-94)在苯福林(phenylephrine,PE)引起的肺动脉收缩中的作用.方法:常规离体血管灌流法检测肺动脉环张力;采用钙荧光探针(Fura-2/AM)负载急性酶分离法(胶原酶Ⅰ型和木瓜蛋白酶)获得的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),观察NFA和IAA-94对PE诱导的PASMCs胞浆游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响,用荧光分光光度计法检测[Ca2+]i.结果:钙激活氯离子通道阻断剂NFA和IAA-94可以舒张PE引起的肺动脉环收缩;NFA和IAA-94对KCl引起的血管收缩无影响;PE可以引起[Ca2+]i升高,NFA和IAA-94对PE诱导[Ca2+]i升高无影响.结论:钙激活氯离子通道在生理状态下与血管活性药(PE)引起的肺动脉张力变化有关,这为研究其在低氧肺血管收缩中的作用提供了新的线索.
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CaCCs通道钙离子依赖性机制的研究进展
钙激活氯离子通道(CaCCs)是一种广泛存在的氯离子通道,参与众多生理功能,如:上皮细胞的离子分泌、嗅觉传导以及平滑肌收缩等.由于通常情况下很难将CaCCs介导的电流和钙离子依赖性阳离子流以及非钙离子依赖性氯离子流分开,因此其钙离子依赖性机制的研究远远滞后于其他离子通道.本文综述了新报道的CaCCs分子基础跨膜蛋白TMEM16A的发现和确立、结构特点、钙离子结合位点、其电流发生机制,及其相关生理作用以及病理和药理功能的热点问题,并展望该领域的研究发展趋势.
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高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞钙激活氯离子通道的电生理研究
目的 观察肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)钙激活氯离子通道(ClCa)的电生理特性,探讨其在高肺血流性肺动脉高压(PAH)形成过程中的可能作用.方法 SD大鼠40只,随机分为3组:对照组(10只)、假手术组(10只)、模型组(20只).建立模型成功后同条件下饲养11周,用右心导管法测定大鼠右心室压力(RVSP),并检测右心室肥厚指数(RVHI)；急性酶分离法分离出单个PASMC,应用膜片钳全细胞记录模式,测定各组大鼠PASMCs静息膜电位(Em)、ClCa电流(IClCa)及电流密度的改变,比较各组大鼠Ⅰ-Ⅴ曲线的变化,并进行相关性分析.结果 与对照组和假手术组比较,模型组大鼠ClCa内向的尾电流(Itail)的Ⅰ-Ⅴ曲线明显向下移；对照组与假手术组间差异无统计学意义.静息Em与RVSP、RVHI呈正相关(P均＜0.01)；Itail的电流密度与RVSP、RVHI、静息Em均呈负相关(P均＜0.01).结论 腹主动脉-下腔静脉分流所致高肺血流性PAH大鼠,随着肺动脉压的增高,PASMCs的静息Em升高,ClCa的Itail的绝对值增大,Ⅰ-Ⅴ曲线下移,提示ClCa电流的改变可能在高肺血流性PAH的形成过程中起一定作用.
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跨膜蛋白16A在人正常月经周期子宫内膜表达的初步研究
目的:研究跨膜蛋白16A(TMEM16A)在人正常月经周期子宫内膜的表达变化.方法:收集人正常月经周期增殖期及分泌期的子宫内膜,共48例.采用免疫组织化学染色法检测TMEM16A蛋白的定位表达,实时荧光定量PCR测定TMEM16A mRNA表达水平,Western Blot法测定TMEM16A蛋白表达水平.结果:TMEM16A蛋白主要表达于分泌中晚期子宫内膜的腔上皮和腺上皮细胞;与增殖期相比,分泌期子宫内膜中TMEM16A mRNA和蛋白的表达水平均明显升高(P＜0.05).结论:TMEM16A在人正常月经周期不同时期子宫内膜存在差异性表达,其可能受到卵巢雌孕激素的调节,并参与子宫内膜容受性的建立.
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TMEM16A在心肌成纤维细胞中的表达及意义
目的 研究小型猪急性心肌梗死(AMI)后,缺血对心肌成纤维细胞中跨膜蛋白16A(TMEM16A)表达及功能特征的影响.方法 采用三氯化铁(FeCl3)诱发左冠状动脉前降支(LAD)血栓形成的方法 建立AMI模型,AMI术后4h采用血清酶学,超声心动图评价AMI模型.AMI后24 h分离心肌成纤维细胞,用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、膜片钳检测,观察TMEM 16A的表达及形成的电流强度变化.结果 与术前和假手术组相比,AMI组肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌红蛋白(MYO)浓度明显升高;左心室射血分数(LVEF)显著下降[(53.4±1.9)％,P＜0.05];TMEM 16A基因表达显著升高[(1.59±0.15)％,P＜0.05];TMEM16A形成的电流强度明显增强(P＜0.05).刺激电压为+20、+40、+60、+80、+100mV时,电流强度分别为(1.58±0.67) pA/pF、(3.69±1.26) pA/pF、(7.60±2.14) pA/pF、(12.94±2.38) pA/pF和(22.19±2.61) pA/pF.结论 在小型猪心肌成纤维细胞中表达TMEM16A基因.缺血可上调TMEM16A基因表达,并通过影响心肌成纤维细胞中钙激活氯离子通道(CaCC),增强心肌成纤维细胞中钙激活氯电流(ICl,Ca).
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钙激活氯通道 ANO1在小鼠心肌细胞的表达及其功能鉴定
目的：探讨钙激活氯通道蛋白anoctamin 1（ ANO1）在小鼠原代培养心肌细胞中的表达及其功能特性。方法：采用胰酶与胶原酶共同消化，联合2次差速贴壁法获得C57BL／6小鼠原代心肌细胞；并用免疫荧光染色法检测α-横纹肌肌动蛋白，以鉴定心肌细胞纯度；应用RT-PCR检测小鼠心肌细胞ANO1 mRNA的表达；免疫印迹检测ANO1蛋白在小鼠心肌细胞的表达情况；应用荧光淬灭动力学实验检测ANO1钙激活氯通道的功能特性。结果：RT-PCR结果表明原代培养的小鼠心肌细胞表达ANO1 mRNA。免疫印迹实验结果显示原代培养的小鼠心肌细胞表达ANO1蛋白。荧光淬灭动力学实验证实表达于小鼠心肌细胞的ANO1具有钙激活氯通道典型的阴离子转运功能特性。结论：ANO1在小鼠心肌细胞中有明确表达，并具有钙激活氯离子通道特性，提示ANO1是钙激活氯通道的分子基础。
关键词： Anoctamin 1 钙激活氯离子通道 心肌细胞 -
小鼠气道杯状细胞钙激活氯离子通道胞外段基因的克隆及表达
目的: 克隆并表达小鼠气道杯状细胞的特定钙激活Cl-通道(mCLCA3). 方法: 根据GenBank(No.NM-017474)的信息, 设计针对mCLCA3的3个胞外段基因的引物.以重组质粒pcDNA3.1(-)/mCLCA3为模板, PCR法扩增3个胞外段的基因.将N端和C端胞外段基因分别亚克隆到原核表达载体pRSET-A中, 中间胞外段基因则亚克隆入原核表达载体pGEX-T1中.分别转化大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞, 使用IPTG诱导表达.结果: 酶切鉴定和序列分析表明, 克隆的mCLCA3的3个胞外段基因序列与GenBank中登录的完全一致.将这些基因亚克隆到相应表达载体, 经IPTG诱导在大肠杆菌中获得表达, 并且表达产物主要以包涵体的形式存在. 结论: 获得了mCLCA3抗原分子胞外段基因及其原核表达产物, 对进一步制备单克隆抗体, 探讨mCLCA3的通道调控机制具有重要意义.
