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3种组织来源的间充质干细胞体外成骨能力的比较
目的 比较成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)、人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)和人胎盘间充质干细胞(P-MSCs)的成骨能力.方法 用含10%胎牛血清的DMEM/Ham's F-12培养液培养3种MSCs,CCK8法检测增殖能力,流式细胞仪鉴定3种细胞.碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色观察细胞经成骨诱导后成骨分化蛋白- ALP的分泌和矿化钙结节的沉积.实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测MSCs骨再生相关基因的表达.Western blot方法检测MSCs成骨再生相关基因的蛋白表达.结果 MSCs在第3天进入对数增殖期.3种细胞的表面标志物阳性率:CD44、CD90和CD105均高于98%.3种MSCs成骨诱导9 d时,3种MSCs的实验组均表达大量成骨分化蛋白-ALP,成骨诱导18 d时3种MSCs均呈现较好的矿化能力;3种MSCs成骨诱导9 d时,实验组RUNX2和ALP基因显著性高表达(P<0.05),成骨诱导18 d时,实验组RUNX2和骨钙素(OCN)亦显著性高表达(P<0.05);3种MSCs成骨诱导9 d时,实验组均检测到RUNX2和ALP的蛋白表达;成骨诱导18 d时,实验组细胞亦检测到RUNX2和OCN的蛋白表达.结论 UC-MSCs和P-MSCs具有良好的成骨分化能力,有望作为骨组织工程的种子细胞用于治疗骨缺损.
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利用共培养法诱导人胎盘间充质干细胞向成骨细胞分化
目的：观察体外人足月胎盘间充质干细胞（ hPMSCs ）和成骨细胞共培养体系条件下成骨细胞对hPMSCs分化的影响。方法采用胶原酶消化法从人足月胎盘中分离纯化间充质干细胞（ MSCs），检测细胞表面标志物、生长曲线、细胞超微结构及成骨能力并对hPMSCs进行鉴定。共培养组将成骨细胞接种于Tran-swell双层培养皿底层， hPMSCs接种于上层；对照组上层与底层均接种hPMSCs。对诱导后细胞进行碱性磷酸酶染色鉴定。结果胎盘分离细胞经形态、生长速度、细胞表面标志物（ CD44和CD29阳性表达为99％， CD34和CD106为1％），确定为胎盘间充质干细胞；头盖骨分离细胞经碱性磷酸酶染色确定为成骨细胞。采用Transwell共培养hPMSCs 和成骨细胞组碱性磷酸酶活性染色阳性率为（21.7±5.3）％，表现成骨细胞特性，对照组染色呈阴性。结论人足月胎盘含MSCs，与其他来源MSCs生物学特性相似，成骨细胞生长过程提供的微环境对hPMSCs分化为成骨细胞具有诱导促进作用。
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人脐带源和胎盘源间充质干细胞的生物学特性比较
目的：探讨人脐带和胎盘来源间充质干细胞（ MSCs）的分离培养和生物学性状的差异，为MSCs的临床应用提供选择依据。方法利用组织贴壁法分离培养脐带MSCs，酶消化法分离培养胎盘MSCs。传代培养后于倒置显微镜下观察两种不同来源的MSCs的细胞形态，流式细胞仪检测两者表面标志物表达的差异，通过细胞周期和群体倍增时间测定比较两者生长增殖能力，体外成骨和成脂诱导比较其分化能力。结果胎盘MSCs和脐带MSCs为贴壁生长、形态均一的成纤维样或长梭形外观，两种细胞均高表达CD90、CD105，不表达CD34、CD45、HLA-DR。胎盘MSCs的群体倍增时间为40．8 h，52．12％处于G0／G1期，脐带MSCs的群体倍增时间为39．5 h，57．50％处于G0／G1期，表明两者增殖能力旺盛，且无明显差异；两者在体外均可诱导分化成骨细胞和脂肪细胞。结论胎盘源MSCs具有与脐带源MSCs相似的生物学特性，两者均可作为临床治疗用细胞或组织工程的种子细胞。
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尿酸对人胎盘间充质干细胞增殖的影响
背景:尿酸对不同细胞具有不同的作用,那么,尿酸对人胎盘源间充质样干细胞是促进还是抑制呢?目的:观察尿酸对人胎盘间充质干细胞增殖的影响及对胎盘间充质干细胞作用的时间-效应及剂量-效应关系.方法:以体外培养人胎盘间充质干细胞为研究对象,分为6 组,不加尿酸的对照组,和加入不同浓度的尿酸0.1,0.2,0.4,0.6,0.8 mmol/L 组.结果与结论:同一时间内,随着尿酸浓度增加,细胞数目逐渐增加,尤其是0.8 mmol/L 尿酸组;同一浓度尿酸,随着培养时间的延长(时间< 5 d),细胞数目也逐渐增加,第5 天的时候细胞数目达到高峰.提示尿酸具有呈时间及浓度依赖性的促进胎盘间充质干细胞增殖的作用,尤其是0.8 mmol/L 尿酸在培养第5 天的时候促进作用明显.
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人胎盘与骨髓源性间充质干细胞体外培养及生物学特性对比
背景:组织工程修复大块组织缺损需要高浓度、大量的细胞接种,骨髓间充质干细胞是种子细胞的主要来源,但存在数量上的局限性及长期传代后细胞功能老化的问题.目的:体外分离培养、扩增人胎盘源性间充质干细胞与人骨髓间充质干细胞,并对其生物学性状进行比较.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-09/2009-02在东直门医院实验室完成.材料:胎盘由解放军空军总医院妇产科提供,骨髓来源于健康成人献髓者.方法:采用密度梯度离心法从胎盘中分离、纯化和传代培养人胎盘源性间充质干细胞;骨髓肝素抗凝后,采用密度梯度离心法分离、纯化和传代培养入骨髓基质干细胞.主要观察指标:用倒置相差显微镜观察两种细胞形态及细胞生长情况,流式细胞仪分析检测第5代细胞表面标志的表达,Von Kossa染色及油红O染色检测分化能力.结果:镜下两种细胞均为贴壁生长,形态为均一成纤维细胞样,传5代后细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降,体外培养10代后细胞生长速度减慢,但人胎盘源性间充质干细胞扩增倍数较人骨髓基质干细胞平均高出两三个数量级.两种细胞具有均一的细胞衷型,均表达CD29,CD44,CD166,不表达CD34,CD45,HLA-DR.两种细胞都具有成骨、成脂分化潜能,但人胎盘源性间充质干细胞分化潜能更强.结论:人胎盘源性间充质干细胞与人骨髓基质干细胞具有相似的生物学特性,且前者具有更强的增殖能力.
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三种间充质干细胞向神经元样细胞的诱导与分化
背景:作为采集方便、来源广泛、潜能巨大的细胞来源,干细胞在疾病细胞疗法的研究已发展壮大,其中常见使用的干细胞有骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和脐血间充质干细胞.目的:比较骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和脐血间充质干细胞与神经细胞的共培养后的变化.方法:体外分离培养人骨髓间充质干细胞、人胎盘间充质干细胞和人脐血间充质干细胞,通过Transwell平板与神经细胞共培养,观察间充质干细胞分化成神经细胞的形态及神经元特异性烯醇化酶表达的变化.结果与结论:神经共培养系统中3种间充质干细胞均逐渐变为星状,并出现相互连接,且阳性表达神经元特异性烯醇酶.表明神经细胞提供的微环境可以诱导及促进3种间充质干细胞向神经元样细胞分化.
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人胚胎脑组织蛋白提取物诱导人胎盘间充质干细胞向神经细胞的分化
背景：选择合适的诱导方法诱导人胎盘间充质干细胞分化为神经元样细胞是临床治疗神经损伤的关键。
目的：在人胎盘间充质干细胞中加入商品化的人胚胎脑组织蛋白提取物，观察其诱导分化为神经元样细胞的可行性。
方法：采用酶消化法分离培养人胎盘间充质干细胞，传至第3代，将人早期胚胎脑组织蛋白提取物加入诱导培养基培养6 d，加入浓度为20 nmol/L全反式维甲酸和500μg/L音猬因子培养3 d，换新的培养液，包含体积分数为10%胎牛血清，10μg/L脑源性神经营养因子，20μg/L神经胶质细胞源性神经营养因子，50μg/L胰岛素样生长因子Ⅱ型继续培养3 d。
结果与结论：胎盘组织经酶消化后获得贴壁细胞，传至第2代细胞形态为梭形，成漩涡样生长，传至第3代细胞形态较均一。诱导后细胞经免疫细胞化学法检测均表达神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白、神经生长相关蛋白43；ELISA法检测细胞培养上清脑源性神经营养因子、神经营养因子3、神经营养因子4为阳性表达；RT-PCR检测细胞微管相关蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、神经生长相关蛋白43均为阳性表达。结果表明人胚胎脑组织蛋白提取物使人胎盘间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞。 -
人胎盘间充质干细胞的超微结构及其吞噬功能
背景：胎盘间充质干细胞组织来源丰富，与骨髓间充质干细胞有着类似的形态、表面标记物、潜在分化能力，是人体理想的间充质干细胞来源之一。目前对胎盘间充质干细胞超微结构和吞噬功能的研究较少，对其在胎盘组织中的生理功能也鲜有探讨。目的：了解胎盘间充质干细胞的超微结构和吞噬功能。方法：分离培养5个正常娩出胎盘来源的胎盘间充质干细胞，经体外培养后在透射电子显微镜下观察细胞的超微结构；在培养上清中添加荧光微球，孵育3h后用流式细胞仪检测细胞的吞噬能力。结果与结论：胎盘间充质干细胞在透射电镜下表现为细胞核比较大，核仁明显；核膜折叠、内陷显著，常染色质多，核浆比例正常。内质网系统发达，可见大量狭小或扩张的粗面内质网。胞浆内高尔基器、溶酶体常见；细胞表面微绒毛发达，偶可见细胞间连接。5个标本的胎盘间充质干细胞中均有部分细胞能吞噬荧光微球，多有49.6%，少有18.4%。上述胎盘间充质干细胞的超微结构特点提示细胞功能活跃，可合成和分泌大量蛋白质，并具有吞噬功能；而吞噬实验进一步验证胎盘间充质干细胞吞噬异物的能力，提示胎盘间充质干细胞在胎盘中可能起着维持微环境稳态、清除异物的功能。
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转染leptin的胎盘间充质干细胞对放射损伤复合创伤愈合的促进作用
目的：探讨瘦素（leptin）和人胎盘间充质干细胞（HPMSCs）对大鼠背部放射损伤复合创伤（放创复合伤）皮瓣愈合的促进作用，阐明其在放创复合伤愈合过程中的协同作用。方法：将30只雄性 Wistar大鼠随机分为转染 leptin的 HPMSCs组（n＝10）、转染空载体的 HPMSCs组（n＝10）和空白对照组（n＝10）。建立放创复合伤大鼠模型，放疗后24 h各组大鼠局部皮下注射转染 leptin的 HPMSCs、转染空载体的 HPMSCs以及生理盐水，观察各组大鼠皮瓣颜色、皮纹、质地、温度、毛发生长、渗出、坏死范围及针刺出血情况；检测各组大鼠皮瓣成活率；HE染色观察各组大鼠皮瓣组织形态表现；免疫组织化学法检测大鼠皮瓣中 leptin和血管性血友病因子（vWF）的表达情况。结果：给药后第7天，各组大鼠皮瓣成活与坏死界限基本清楚，坏死区域皮瓣质地坚硬，成活区域皮瓣颜色红润，皮纹模糊，质地中等，转染 leptin 的 HPMSCs 组和转染空载体的HPMSCs组大鼠皮瓣坏死面积均小于空白对照组。给药后第7天，转染 leptin的 HPMSCs组大鼠皮瓣成活率高于转染空载体的 HPMSCs组和空白对照组（P＜0.05），转染空载体的 HPMSCs组大鼠皮瓣成活率高于空白对照组（P＜0.05）。给药后第14天，HE染色检测，转染 leptin的 HPMSCs组大鼠皮瓣肉芽组织为丰富，新生毛细血管和成纤维细胞多。给药后第14天，免疫组织化学染色，转染 leptin的 HPMSCs 组和转染空载体HPMSCs组大鼠皮瓣真皮下方可见大量的黄染颗粒（阳性表达），转染 leptin的 HPMSCs组胞浆中阳性表达的leptin细胞多。结论：在局部微环境作用下， HPMSCs 可以分化为血管内皮细胞，促进新生血管的形成， HPMSCs与 leptin可协同促进放创复合伤皮瓣的愈合， HPMSCs携带目的基因或单独应用均可明显提高放创复合伤皮瓣的成活率，但转染 leptin的 HPMSCs作用力更强。
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人胎盘源间充质干细胞的分离、培养及生物学鉴定
目的:探讨机械剪碎组织加酶液消化法分离、培养人胎盘间充质干细胞的可行性,并对间充质干细胞进行生物学鉴定.方法:取足月产人胎盘,采用机械剪碎组织加酶液消化法分离,密度梯度离心法提纯胎盘组织中的细胞,利用细胞生长特性对细胞进行进一步分离、纯化并传代培养,倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞术鉴定细胞表面标记.结果:在倒置显微镜下,细胞为贴壁生长,形态呈长梭形,少数为多角形,胎盘组织来源间充质干细胞在体外可稳定长期传代培养,应用流式细胞仪检测结果显示CD73、CD90、CD105表达阳性,CD34 、CD45、HLADR表达阴性.结论:联合利用机械剪碎胎盘组织和酶消化法可高效获取胎盘间充质干细胞,获取的胎盘间充质干细胞在体外培养过程中生长稳定,增殖能力强,可长期传代或冻存.
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PD-L2在人胎盘间充质干细胞上的表达及其生物学意义
目的 探讨PD-L2在人胎盘间充质干细胞黏附和迁移过程中的生物学意义.方法 应用消化法分离、培养人胎盘间充质干细胞,体外扩增培养3代后用于实验；RT-PCR检测PD-L2在人胎盘间充质干细胞上的表达；应用化学合成的PD-L2 siRNA阻断PD-L2在人胎盘间充质干细胞上的表达;细胞计数法检测人胎盘间充质干细胞的黏附能力；Transwell法检测人胎盘间充质干细胞的迁移能力.结果 人胎盘间充质干细胞高表达PD-L2分子,PD-L2 siRNA能有效阻断人胎盘间充质干细胞对PD-L2的表达；细胞计数结果显示,接种后0.5 h阻断组人胎盘间充质干细胞的黏附率与正常对照组相比无显著升高,在接种后1h和3h,阻断组人胎盘间充质干细胞的黏附率均明显高于正常对照组;Transwell检测结果显示,与正常对照组相比,在DMEM-LG、含SDF-1α的DMEM-LG、人胎盘间充质干细胞培养上清三种培养条件下,阻断组细胞迁移率均显著降低.结论 PD-L2表达在人胎盘间充质干细胞,且在人胎盘间充质干细胞的黏附和迁移中发挥重要作用.
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人胎盘间充质干细胞移植对化疗所致卵巢早衰大鼠卵巢功能的影响
目的 研究人胎盘间充质干细胞(hPMSC)移植对环磷酰胺诱导的卵巢早衰(POF)模型大鼠卵巢功能修复过程中沉默信息调节因子1(SIRT1)、过氧化物酶体增殖物活化受体γ共激活因子1-α(PGC1-α)以及核转录因子E2相关因子2(Nrf2)活性的影响.方法 将60只雌性SD大鼠随机分为空白对照组、POF模型组、hPMSC治疗组、治疗对照组,每组15只.通过大鼠腹腔注射环磷酰胺建立POF模型,治疗组于造模成功后给予hPMSC治疗.采用ELISA法测定血清中雌二醇(E2)、促卵泡生成素(FSH)、抗苗勒管激素(AMH)水平;HE染色法和Van Gieson染色观察卵巢组织形态学和纤维化变化,Western blotting和免疫组织化学法检测卵巢组织SIRT1、PGC1-α、Nrf2的表达水平.结果 ELISA结果显示,POF模型组血清FSH水平明显高于空白对照组(P<0.05),而E2、AMH水平则明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01);与POF模型组和治疗对照组相比,hPMSC移植治疗后FSH水平下降,AMH水平升高,差异有统计学意义(P<0.01).HE染色结果显示,POF模型组卵巢组织结构紊乱,原始卵泡和初级卵泡减少,闭锁卵泡增加,hPMSC治疗组中正常形态卵泡数目增多,闭锁卵泡数目减少.免疫组织化学结果显示,POF模型组SIRT1、PGC1-α、Nrf2蛋白表达相对于空白对照组降低,hPMSC治疗组蛋白表达相对于POF模型组升高.Western blotting结果显示,与空白对照组相比,POF模型组SIRT1、PGC1-α、Nrf2蛋白表达显著降低(P<0.01);与POF模型组相比,hPMSC治疗组SIRT1、PGC1-α、Nrf2蛋白表达显著升高(P<0.01).结论 hPMSC移植对POF模型大鼠有抗氧化与修复卵巢功能的作用,其机制可能与激活SIRT1/PGC1-α/Nrf2信号通路有关.
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体外传代的人胎盘间充质干细胞的生物学特性及遗传特性研究
目的：研究人胎盘间充质干细胞(human placenta mesenchymal stem cells,hPA-MSCs)在体外传代过程中生物学特性及遗传特性的变化,为 hPA-MSCs 临床应用的安全性提供理论依据。方法对无血清培养基培养的 hPA-MSCs 第1、3、5、7、10、13、17、20代体外培养细胞进行细胞形态观察、细胞周期分析、免疫表型分析、染色体核型分析及相关基因和细胞因子的定量分析。结果发现在传代过程中 hPA-MSCs 细胞形态无明显变化,呈梭形或短梭形；hPA-MSCs 约93%的细胞处于 G0/G1期,保持稳定；染色体核型无明显缺失、易位和倒位等变化；细胞因子表达量保持稳定；相关基因表达整体呈下降趋势,但前5代细胞各基因表达量仅有微小变化,遗传特性基本稳定。结论无血清培养基培养的 hPA-MSCs 在体外传代至第5代基本安全。
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hp-MSCs对RSV引起小儿毛细支气管炎的保护作用及机制研究
目的 探讨人胎盘间充质干细胞(hp-MSCs)水平降低与毛细支气管炎发病的相关性及hP-MSCs防治毛细支气管炎的分子机制.方法 在滨州医学院附属医院产科招募志愿者,同时收集新生儿胎盘.毛细支气管炎患者由儿科医生根据临床诊断标准做出诊断;以毛细支气管炎患者为病例组,正常体检儿童为对照组,进行病例对照研究;胎盘hp-MSCs水平检测采用锥虫蓝染色计数法,hp-MSCs表面标记物的检测采用流式细胞仪方法;采用ELISA(酶联免疫吸附法)检测白细胞介素-9(IL-9)、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β1 (TGFβ-1)水平,采用Real time PCR和Western blot法检测叉头框蛋白3(Foxp3)及维甲酸相关孤核受体γt(RORγt)基因和蛋白表达水平.结果 两组人群在是否存在特异性皮炎、毛细支气管炎1级和2级家族史有显著性差异(P＜0.05).病例组hp-MSCs水平及其表面标记物CD44和CD29水平显著降低(P＜0.05).呼吸道合胞体病毒(RSV)感染升高IL-17和IL-9等炎症因子水平,降低IL-10和TGFβ-1等抗炎因子水平;而hp-MSCs干预可以降低IL-17和IL-9水平而升高IL-10和TGFβ-1水平(均P＜0.05).RSV感染可以下调Foxp3基因和蛋白表达,上调RORγt基因和蛋白表达;而hp-MSCs干预可以上调Foxp3基因和蛋白表达,下调RORγt基因和蛋白表达.结论 胎盘hp-MSCs水平降低是引起婴幼儿毛细支气管炎的独立危险因素,hp-MSCs通过上调Foxp3的蛋白和基因表达,以及下调RORγt蛋白和基因表达起到防治婴幼儿毛细支气管炎的作用.
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瘦素基因在人胎盘间充质干细胞中转染与表达
目的：构建瘦素（leptin）基因真核表达载体，将其转染至人胎盘间充质干细胞（HPMSCs）中并鉴定其表达。方法：设计leptin基因引物，从人脂肪组织中RT-PCR扩增leptin基因，将获得的基因插入真核表达载体pIRES2-EGFP中，得到重组质粒pIRES2-EGFP-LEP，限制性内切酶双酶切鉴定重组质粒；用脂质体法将重组质粒转染至 HPMSCs 中并通过 RT-PCR及Western blotting法检测目的基因表达，鉴定转染后HPMSCs 的多向分化潜能。结果：RT-PCR扩增得到的特异性片段长度约为500 bp，重组质粒经双酶切后显示5．3 kb和500 bp左右的2条片段；转染后的HPMSCs表达leptin基因，保持多向分化潜能。结论：成功构建了瘦素基因真核表达载体，将其转入HPMSCs中并得以表达。
