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CMV与T7启动子对仙台病毒微小基因组拯救效率的比较
构建一种以分泌型荧光素酶基因(Gluc)作为报告基因的仙台病毒BB1株微小基因组质粒,比较了CMV启动子与T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率.首先设计并合成锤头状核酶序列,仙台病毒trailer、L基因非编码区、N基因非编码区和leader序列以及丁型肝炎病毒核酶序列,插入含有CMV和T7双启动子的质粒pVAX1中,获得仙台微小基因组的通用型载体pVAX-miniSeV.将Gluc基因插入pVAX-miniSeV中,分别获得正向插入的仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV-Gluc(+)和反向插入的pVAX-miniSeV-Gluc(-).用pVAX-miniSeV-Gluc(+)转染BHK21细胞能在上清中检测到高水平的Gluc活性,表明其中的CMV启动子具有正常转录功能.将pVAX-miniSeVGluc(-)和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒共转染BSR T7/5细胞(稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK-21细胞)检测到Gluc的高效表达,表明pVAX-miniSeV-Gluc(-)能够被有效拯救；但在BHK-21细胞中却未检测到Gluc的有效表达,提示该载体中的CMV启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率可能没有明显作用.为了进一步了解CMV与T7启动子各自对于仙台病毒微小基因组拯救的作用,本研究又构建了单独含有CMV或T7启动子的仙台病毒微小基因组载体pCMVminiSeV-Gluc(-)和pT7-miniSeV-Gluc(-).将这两种载体和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒分别共转染BSR T7/5细胞,结果pT7-miniSeV-Gluc(-)共转染组检测到了Gluc的高效表达,而pCMV-miniSeV-Gluc(-)共转染组未检测到,证实了通用型载体pVAX-miniSeV中仅T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救起了关键作用,而CMV启动子作用不明显.本研究成功构建了一种通用型双启动子仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV,并证明了T7启动子系统对仙台病毒微小基因组拯救的关键作用.本研究为下一步构建仙台病毒全基因感染性克隆打下了基础.
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带有CMV、CEA误启动子的腺病毒载体介导TK基因在肿瘤细胞中的表达特性
TK基因-GCV系统是有希望在临床上用于肿瘤基因治疗的方法之一.为了提高基因靶向表达的效率,使之可以应用于体内实验,我们构建重组腺病毒AdCMVTK和带有CMV、CEA两个启动子的AdCMVCEATK,在五种癌细胞中进行了体外实验.发现腺病毒介导的TK基因赋予癌细胞GCV敏感性比对照组高2～3个数量级,并使感染病毒和未感染病毒细胞比例为1:10时仍产生较强的"旁观效应".实验表明PG肺癌,CAE结肠癌,HeLa细胞是腺病毒介导的TK基因的理想靶细胞.
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含不同启动子的重组9型腺相关病毒载体转染大鼠心肌细胞表达效率的差异
9型腺相关病毒( AAV9)作为基因治疗心脏疾病的佳载体之一而成为近年来研究的热点[1],但影响AAV9转导效率的因素很多,其中载体上的启动子和受体细胞是否合适是直接影响到目的基因的转录效率和表达水平的重要因素[2],本研究分别选用含CMV启动子和CBA启动子的rAAV9携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染心肌细胞,比较两个启动子在心肌细胞的转录活性以及对细胞生长的影响,从而为AAV9携带靶基因高效转染心肌细胞以及应用于心脏疾病的基因治疗提供实验资料.
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用于CMV启动子序列检测的绝对定量PCR方法的建立及验证
目的 建立和验证用于CMV启动子序列检测的绝对定量PCR方法.方法 针对CMV启动子序列设计探针和引物,用SYBR Green I熔解曲线分析引物扩增的特异性.对反应体系进行系统优化.用含CMV启动子的基因治疗产品和质粒标准品验证建立的PCR方法.结果 上游引物为5′-AGACTTGGAAATCCCCGTGAGT-3′,下游引物为5′-CGTATTAGTCATCGC-TATTACCATGGT-3′,探针为5′- AACCGCTATCCACGCCCATTGATG -3′.扩增的特异性较强,反应体系优化后能达到较高的灵敏度.Ct值的变异系数都小于2％.标准曲线的定量范围为1.5×102～ 1.5×107拷贝,灵敏度为30拷贝.质粒标准品和基因治疗产品的扩增效率相近.结论 建立了检测CMV启动子序列的绝对定量PCR方法.
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广泛表达人载脂蛋白E3转基因小鼠的建立
目的 建立人载脂蛋白E3(apolipoprotein E3,ApoE3)转基因小鼠,研究该基因在多种组织中表达水平的变化对动物的影响,探索该基因的功能.方法 RT-PCR法克隆人ApoE3基因,把该基因插入CMV启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立转ApoE3基因C57BIJ6J小鼠.并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Westem blot检测基因表达水平.通过生化指标分析初步鉴定ApoE3基因的功能.结果建立了2个系的高表达人ApoE3转基因小鼠.结论 成功建立了CMV启动子启动的高表达人ApoE3基因转基因小鼠,为进一步探索该基因的功能奠定了基础.
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双顺反子表达载体DV的构建及其表达效率
目的 构建双顺反子表达载体DV,并检测其表达效率.方法 以载体VR1012为模板,PCR扩增BGH基因和启动子CMV-intronA基因片段,分别连接至载体VR1012启动子和终止子之间的相应位点上,构建双顺反子表达载体DV.另以质粒pshuttle-luciferase为模板,PCR扩增报告基因luciferase片段,分别连接至DV的两个启动子后,得到质粒DV-luc1和DVluc2.将质粒DV-luc1、DV-luc2和阳性质粒pshuttle-luciferase分别转染COS-7细胞,Western blot检测lucfferase蛋白的表达情况,荧光酶标仪检测luciferase降解底物的水平.结果 双顺反子表达载体DV经双酶切鉴定证明构建正确；转染重组质粒DV-luc1和DV-luc2的COS-7细胞中均有luciferase的表达,且表达效率DV-luc2略高于DV-luc1.结论 已成功构建了双顺反子表达载体DV,且载体的第2个启动子的启动效率略高于第1个启动子,为基因治疗、转录调控、多价疫苗等的研究奠定了基础.
关键词： 双顺反子 启动效率 CMV启动子 luciferase报告基因 -
双启动子报告基因表达载体的构建及其在真核细胞中表达活性测定
目的研究含双启动子表达载体在真核细胞中的表达活性。方法构建分别含有CMV及CMV-SV40启动子的pC-LacZ及pCS-LacZ真核表达载体。用阳离子脂质体Lipofectamine将其转染至TJ905真核细胞中。对转染后24～72h的细胞提取物进行β-半乳糖苷酶活性检测；并与转染标准pSV-gal载体的细胞提取物的酶活性进行比较分析。结果 TJ905细胞中转染pCS-LacZ的β-半乳糖苷酶活性明显高于其它两种载体(P<0.05)，且转染后48h是酶活性达高峰的时间。结论两种启动子同时启动的基因表达效率较高，这为今后基因治疗中提高外源基因表达效率提供了一条有益的探索之路。
关键词： CMV启动子 CMV-SV40启动子 β-半乳糖苷酶 活性测定 -
电离辐射对不同启动子驱动的GFP报告基因表达的影响
目的研究电离辐射调控脂质体介导的EGR-1基因启动子、CMV启动子驱动的GFP报告基因在人肝癌7402细胞内的表达.方法利用CMV启动子、EGR-1基因启动子构建pcDNA3-CMV-GFP、pcDNA3-EGR-GFP重组质粒,经阳离子脂质体LipofectAMINE介导转染人肝癌7402细胞株,对脂质体转染条件进行优化,在佳转染条件下,分别给予不同浓度H2O2、不同剂量γ射线处理转染细胞,用荧光显微镜、流式细胞仪(FACS)检测GFP的表达情况.结果FACS 检测显示氧自由基、电离辐射可诱导EGR-1基因启动子驱动的GFP基因表达,而不诱导CMV启动子驱动的GFP表达.结论EGR-1基因启动子具有电离辐射诱导特性.
关键词： Egr-1基因启动子 CMV启动子 阳离子脂质体 电离辐射 -
不同启动子调控的PNP基因载体的构建和表达差异性分析
目的分别构建巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)通用启动子和甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)组织特异性启动子调控的PNP基因表达载体并分析二者表达的差异性.方法将AF0.3启动子插入载体pcDNA3.0, 构建肝癌细胞特异表达载体pAF0.3;将PNP基因分别插入到pcDNA3.0和pAF0.3 中,构建不同启动子调控下的PNP基因表达载体pcDNA3.0/PNP和pAF0.3/PNP;通过酶切、PCR及测序鉴定各重组体.采用脂质体介导法将两种PNP基因表达载体转染不同的细胞株,RT-PCR检测PNP基因在各细胞株中的表达,分析二者表达的不同.结果各目的片段均成功插入相应的载体中,CMV启动子调控下的PNP基因在各株细胞中均实现了表达,而AF0.3启动子调控下的PNP基因则在AFP阳性肝癌细胞中实现了组织特异性表达.结论两PNP基因表达载体是肝癌基因治疗中新型、高效的治疗载体,且pAF0.3/PNP还实现了在AFP阳性肝癌细胞中的靶向性表达.
关键词： PNP/Mep-dR系统 CMV启动子 AF0.3启动子 基因表达 肝细胞癌 -
不同启动子和MAR组合对重组CHO细胞转基因表达的影响
目的 分析不同启动子与核基质结合区(MAR)组合对中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中转基因表达的影响.方法 将β-珠蛋白MAR(gMAR)与人巨细胞病毒早期启动子(CMV-IE)、猿猴空泡病毒40(SV40)启动子组合,构建两种不同启动子与gMAR组合的表达载体.转染CHO细胞,48 h后观察增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的瞬时表达情况;G418筛选稳定转化的细胞株,流式细胞术分析稳定CHO细胞eGFP基因的表达水平,实时荧光定量PCR(qPCR)分析eGFP基因的相对拷贝数.结果 不含gMAR的表达载体,CMV-IE启动子eGFP表达明显强于SV40启动子;gMAR能提高CMV-IE启动子eGFP表达水平,但在SV40启动子中并未表现出提高作用.两侧含gMAR的表达载体比一侧含有gMAR的表达载体CMV-IE启动子eGFP表达荧光强;G418加压筛选后,含SV40启动子的gMAR表达载体eGFP基因表达不稳定,荧光逐渐减弱,因此,后期只对稳定表达eGFP基因的CMV-IE启动子表达载体进行流式细胞术和qPCR分析.流式细胞术检测结果显示,一侧含有与两侧含有gMAR的CMV-IE启动子表达载体eGFP基因表达量比不含gMAR的表达载体分别提高9.85倍和12.94倍;qPCR结果显示,以不含gMAR的载体的eGFP基因拷贝数为1,一侧含有与两侧含有gMAR的CMV-IE启动子表达载体eGFP基因相对拷贝数为3.68和9.25.结论 CMV-IE启动子活性强于SV40启动子;gMAR能提高CMV-IE启动子外源基因的表达水平,其机制可能与增加基因拷贝数相关.
