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精神分裂症血浆中差异表达miRNA 的辅助诊断价值初探
目的：检测与精神分裂症相关的血浆中差异表达微小 RNA （miRNA），探寻有精神分裂症诊断价值的生物标记。方法：选择6例首发、未用药的符合美国精神障碍诊断与统计手册第4版（DSM-IV）诊断的精神分裂症患者及6例年龄、性别匹配的正常对照者（筛查样本），采用 TaqMan Array 人类微小 RNA 芯片（TaqMan Array Human MicroRNA A ＋B Cards Set v3.0）高通量检测了754个 miRNA （SangerhumanmiRBase v14）的血浆表达水平，并用 SAM 软件的 t 检验分析病例和对照组间 miRNA 表达水平的差异；进而在独立的25例精神分裂症患者和18例正常对照（验证样本）中，采用实时荧光定量 PCR （RT-PCR）方法进行检测与分析，采用 t 检验比较两组 miRNA 表达水平差异。结果：筛查样本中精神分裂症患者有20个 miRNA 的表达水平低于正常对照，并通过 FDR 多重比较校正；根据差异表达 miRNA 的显著性和既往文献报道，选择其中8个差异表达 miRNA 进行独立样本验证，发现这些 miRNA 在验证样本的精神分裂症血浆中表达下调，且其中4个 miRNA：hsa-miR-15b-5p 经过 FDR 多重比较校正后仍有统计意义。结论：精神分裂症患者血浆中有多个 miRNA 低表达，这些低表达的 miRNA 对精神分裂症的诊断有参考意义。
关键词： 微小 RNA 精神分裂症 TaqMan Array 实时定量 PCR -
用于CMV启动子序列检测的绝对定量PCR方法的建立及验证
目的 建立和验证用于CMV启动子序列检测的绝对定量PCR方法.方法 针对CMV启动子序列设计探针和引物,用SYBR Green I熔解曲线分析引物扩增的特异性.对反应体系进行系统优化.用含CMV启动子的基因治疗产品和质粒标准品验证建立的PCR方法.结果 上游引物为5′-AGACTTGGAAATCCCCGTGAGT-3′,下游引物为5′-CGTATTAGTCATCGC-TATTACCATGGT-3′,探针为5′- AACCGCTATCCACGCCCATTGATG -3′.扩增的特异性较强,反应体系优化后能达到较高的灵敏度.Ct值的变异系数都小于2％.标准曲线的定量范围为1.5×102～ 1.5×107拷贝,灵敏度为30拷贝.质粒标准品和基因治疗产品的扩增效率相近.结论 建立了检测CMV启动子序列的绝对定量PCR方法.
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常用分子生物学技术在食品病原微生物检测中的应用
食品微生物检测对于保障食品安全起着及其重要的作用。传统的微生物检测方法虽然有效，但存在检测成本高、速度慢、效率低等问题，难以满足现代社会快速检测的要求。随着细菌基因组学和分子生物学技术的飞速发展，诞生了许多分子生物学技术，它们因准确度和灵敏度高、特异性强、操作简便、检测周期短、效率高等优点，越来越被广泛应用。
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实时定量 PCR 检测 KIR 转录水平的方法构建
目的：构建可定量检测杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）转录水平的方法。方法筛选 KIR3DS1和KIR3DL1保守区特异性引物，利用 RT-PCR 和熔解曲线法对引物特异性进行检验，建立可定量的标准内参，应用SYBR Green RT-PCR 方法检测标本中 KIR3DS1和 KIR3DL1的 mRNA 含量。结果通过电泳和实时定量 PCR 的熔解曲线明确了 KIR3DS1和 KIR3DL1引物，其特异性好，无杂带。应用 TA 克隆建立的 KIR 定量标准品线性关系好，可检测待测物的范围大。应用临床标本可检测出两组标本有显著差异，符合临床预期。结论本文建立的 KIR mRNA 定量检测方法，可以定量检测活化和抑制性 KIR，可以进一步研究不同疾病进展的机制以及预测疾病的临床转归。
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苦参碱对 HaCaT 细胞 Bcl -2/Bax 和Fas/FasL 的调控
目的：明确苦参碱对 HaCaT 细胞 Bcl-2/ Bax 和 Fas/ FasL 表达的影响。方法：体外培养HaCaT 细胞，选择第二代细胞对数生长期 HaCaT 细胞作为研究对象，将细胞随机分为4组：苦参碱2 mg/ mL、10 mg/ mL 和50 mg/ mL 3组及对照组(加入相同体积的0.9％盐水)，孵育48 h 后，MTT 法测定各浓度下细胞增殖，RT-PCR 检测 Bcl-2/ Bax 和 Fas/ FasL 的表达。结果：与对照组相比，当苦参碱浓度为2 mg/ mL 时，HaCaT 细胞增殖活性无明显变化；Bcl -2、Bax、Fas、FasL 表达也无明显变化( P>0.05)。当苦参碱浓度为10 mg/ mL 时 HaCaT 细胞增殖活性较对照组明显下降(P<0.001)；Bcl-2表达明显下降，Bax 表达上升(P<0.001)；Fas、FasL 表达上升(P<0.05)。当苦参碱浓度为50 mg/ mL 时，MTT法检测 HaCaT 细胞增殖明显抑制(P<0.001)；同时 Bcl-2、 Bax、Fas 和 FasL 的变化与10 mg/ mL 时相似(P>0.05)。结论：苦参碱能够调控上皮细胞致炎因子的表达，抑制细胞的增殖。
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miRNA-373在非小细胞型肺癌中的表达及其临床意义
目的：探讨非小细胞型肺癌石蜡包埋组织中 miR-373的表达与临床病理因素之间的关系，及其在预测非小细胞型肺癌患者预后中的作用．方法：用微阵列芯片法和 qRT-PCR 检测非小细胞型肺癌石蜡包埋组织和癌旁组织中的 miR-373表达．采用 Kaplan-Meier 法分析非小细胞型肺癌患者总生存期和无病生存期．结果：在原发非小细胞型肺癌中 miR-373的表达下调，并用 qRT-PCR 进一步验证．另外，miR-373低表达与病理组织类型、分化程度、淋巴结转移、临床分期、血管浸润、复发时间和生存时间（OS）（P ＜0.05）显著性相关．Kaplan-Meier 分析结果表明， miR-373低表达与高表达患者 OS 和无病生存期（DFS）（P ＜0.05）有显著性差异，miR-373低表达患者预后较差．多因素分析显示非小细胞型肺癌中 miR-373的表达水平是预测 OS 和 DFS（P ＜0.05）的独立危险因素．结论：miR-373的表达与非小细胞型肺癌患者预后显著相关，miR-373可作为预测非小细胞型肺癌患者预后的独立标志物．
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腺病毒介导的 DPP6过表达载体的构建及其在大鼠心肌细胞内表达的鉴定
目的：构建腺病毒介导的 DPP6过表达载体并验证其在大鼠心肌细胞内的表达。方法：应用 PCR 技术扩增目的基因 DPP6，经酶切、连接等反应将目的基因插入穿梭载体 pShuttle-CMV 中，进而转化至含有 AdEasy 质粒的大肠杆菌中，进行重组；所产生的腺病毒载体转染在 HEK-293细胞中，进行腺病毒的包装、分泌和扩增，所得病毒感染大鼠心肌细胞，进行荧光及实时定量 PCR（qPCR）鉴定。结果：DPP6过表达腺病毒载体构建成功，经 HEK293细胞包装、扩增后，所得病毒可成功感染初生大鼠心肌细胞，观测到腺病毒携带的绿色荧光蛋白表达，qPCR 检测DPP6 mRNA 表达明显升高。结论：成功构建了腺病毒介导的 DPP6过表达载体，并在大鼠心肌细胞内成功表达，为进一步研究 DPP6在心肌细胞内的功能奠定了基础。
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实时定量 PCR 与痰涂片检查在结核病诊断中的应用价值研究
目的：研究实时定量 PCR 与痰涂片检查在肺结核诊断中的临床价值。方法：收集120份痰液标本，通过实时定量 PCR 与痰涂片同步检测，比较两组方法的阳性率、灵敏性和特异性。结果：本组80份确诊标本中涂片法阳性率为31．25％（25/80），FQ -PCR 法阳性率为68．75％（55/80）。涂片法的灵敏度和特异度分别为31．25％和95％，FQ -PCR法为68．75％和90％。结论：FQ -PCR 法和涂片法在结核病的诊断中具有各自的优势，是结核病实验诊断的重要手段，应根据实际情况选择合适的检查方法。
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miRNA-141、miRNA-145在非小细胞肺癌中的表达及与临床病理的关系
目的：通过检测 miRNA-141、miRNA-145在非小细胞肺癌中的表达,探讨其与非小细胞肺癌临床病理的关系。方法采用 Real time-PCR 法对48例非小细胞肺癌组织及正常肺组织的 miRNA-141、miRNA-145进行定量分析,结果由2(-△△CT)处理,并分析与临床病理资料的关系。结果①NSCLC 患者肿瘤组织中 miRNA-141表达水平明显升高,而且其表达与临床分期、病理类型显著相关(P <0.05),miRNA-141在鳞癌患者肿瘤组织表达高于腺癌(P <0.05),而在不同年龄、性别、肿瘤大小患者间差异无统计学意义(P >0.05)。②NSCLC 患者肿瘤组织中 miRNA-145表达水平明显下降,而且其表达与临床分期、病理类型显著相关(P <0.05),miRNA-145在腺癌患者肿瘤组织表达低于鳞癌(P <0.05),而在不同年龄、性别、肿瘤大小患者间差异无统计学意义(P >0.05)。结论miRNA-141高表达及 miRNA-145低表达与非小细胞肺癌的临床分期、病理分级密切相关,miRNA-141、miRNA145有可能作为非小细胞肺癌的重要肿瘤标志物。
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肾透明细胞癌患者血浆中 miRNA-378的表达及其临床意义
目的：探讨肾透明细胞癌患者和健康人群血循环中微小 RNA-378（microRNA-378，即 miRNA-378）的表达差异及其临床意义。方法收集肾透明细胞癌患者（肾透明细胞癌组）和健康人群（对照组）血液标本各20例，采用实时定量 PCR 的方法检测两组标本 miRNA-378的表达情况，比较两者的表达差异，并分析 miRNA-378的表达与性别、年龄、民族、肿瘤大小、肿瘤分期、病理分级的相关性。结果与对照组比较，肾透明细胞癌组血浆中 miRNA-378呈现高表达，其表达为（2．13±1．8），平均表达量较对照组升高5倍；miRNA-378的表达水平与患者性别、年龄、民族、肿瘤大小、肿瘤分期、病理级别没有明显相关性。结论肾透明细胞癌患者血浆中 miRNA-378呈现高表达，有可能成为筛查肾透明细胞癌患者的生物学指标。
