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河南省有偿供血者HIV-1外膜蛋白env基因序列分析及表型预测
应用套式聚合酶链反应(nested-PCR)从60例河南省HIV-1抗体阳性有偿献血者的外周血单核细胞的DNA样品中扩增全长env基因并对扩增产物测序,共扩增到21个全长env基因,序列分析发现其中15个env基因有完整的可读框(ORF),14个为B亚型,与国际参考株RL42的基因离散率为4.87%±0.31%,1个为B亚型,与国际参考株HXB2的基因离散率为5.43%.根据核苷酸序列推导出相应的氨基酸序列,并且分析及比较了重要的功能结构域.发现这15个序列的N糖基化位点和数目没有显著变化;CD4受体结合位点高度保守;根据V3环氨基酸序列及净电荷数目,预测大多数分离株使用CCR5辅助受体;V3环四肽序列以典型欧美B亚型GPGR多,占40%;gp120/gp41剪切位点高度保守,预测所有gp160前体都能有效剪切;四种广谱中和抗体2G12、IgG1b12、4E10及2F5的识别位点高度保守,表明大多数分离株对这四种中和抗体敏感.有必要进一步阐明env基因型与相关功能的关系,这将为疫苗研究和药物开发提供依据.
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HIV-1B/C重组型外膜蛋白env基因序列分析及表型预测
目的 克隆并分析HIV-1B/C重组型外膜蛋白env基因序列,根据其氨基酸序列进行表型预测,为疫苗的抗原设计奠定基础.方法 采集北京地区HIV-1 B/C重组型的抗凝全血标本,分离血浆和提取基因组DNA,采用巢式PCR方法扩增rev-env基因,对扩增产物进行序列测定.根据核苷酸序列推导出相应的氨基酸序列,并对重要的Env功能结构域进行深入的分析和比较.结果 从12例B/C重组型HIV-1感染者中成功克隆到7个rev-env基因,序列分析发现其中6个有完整的开放读码框(ORF),全部为CRF_07B/C重组型.6个Env蛋白氨基酸N糖基化位点和数目没有显著变化;CD4受体结合位点高度保守;根据V3环氨基酸序列及静电荷数目预测全部使用CCR5辅助受体;GP120/GP41剪切位点高度保守,预测所有GP160前体都能有效剪切;对几个已知中和抗体的中和位点分析推测全部的6个序列都对2G12、2F5中和不敏感;对4E10、PG9及PG16中和敏感.结论 有必要进一步阐明env基因型与相关功能的关系,这将为疫苗和药物研究提供依据.
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HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因改造及其重组DNA疫苗的构建
目的 构建表达含有密码子优化的HIV-1 CRF01_AE亚型env基因的DNA疫苗,为多载体艾滋病治疗性疫苗的应用提供候选疫苗.方法 对HIV-1感染者血液样本进行型别分析,分型得到的AE亚型标本采用亚型特异性引物克隆env基因,通过序列比对获得其共有序列,对该序列按照哺乳动物密码子使用的偏嗜性进行优化,将人工合成的优化基因克隆至pVR载体,构建DNA疫苗.通过Western Blot方法比较优化前后env基因的表达.结果 成功获得32条具有完整的开放性阅读框的env克隆,型别分析确认均为CRF01_AE亚型.成功对其共有序列进行了优化、合成并构建了DNA疫苗pVR-mod.AE env,该疫苗与野生型的env基因(wt.AE env)相比可以高水平表达env基因,且不依赖Rev的存在.结论 对HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因的优化改造及重组DNA疫苗的构建是成功的.
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HIV-1包膜蛋白2G12和2F5中和表位的改造对假病毒形成及中和活性的影响
目的 研究HIV-1膜蛋白(Env)特定中和表位的改造对功能性假病毒形成及中和活性的影响.方法 采用环形诱变及Dpn I筛选的方法对Env进行定点突变,将2G12和2F5两个中和表位整合入不含该表位的BC亚型的Env上,比较改造对假病毒的形成情况及对2G12和2F5单抗的中和活性的影响.结果 对5株假病毒(BC02、BE03、BC04、BC05和BC12)的Env特定中和表位进行改造,其中BC04和BCl2的2G12表位改造后,不能形成假病毒,BC02、BC03和BC05增加2G12和2F5两个表位后,仍能够形成假病毒,且假病毒滴度较改造前无明显变化,改造后的BC03假病毒较改造前对单抗2G12和2175的中和活性均有所提高,而改造后的BE02和BC05假病毒较改造前对单抗2F5的中和活性增强,而对单抗2G12的中和活性无变化.结论 2G12中和表位部分位点的改造影响假病毒的形成,中和表位的增加能够提高单抗2G12的中和活性,为免疫原的优化提供了新思路.
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人免疫缺陷病毒1(HIV-1)膜蛋白基因片段在酵母中的克隆表达
目的 为获得足够量的膜糖蛋白,以便于对不同HIV分离株膜糖蛋白的结构与功能进行进一步的研究.方法 从人免疫缺陷病毒1(HIV-1)HXB2分离株原病毒基因组的重组质粒pHXB2中克隆了两段膜糖蛋白基因(ENV)片段.以酵母穿梭诱导表达质粒pYES2为载体,构建了两个相应的重组表达质粒pYENV1和pYENV2;进一步利用大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(β-lacZ)构建了HIV-1膜外糖蛋白DNA片段与β-lacZ基因的融合表达质粒.将此3种质粒分别转化单细胞真核生物酿酒酵母BJ1991,得到的转化子经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的SDS-PAGE分析.结果 克隆的基因片段在酿酒酵母中产生了分子质量为50×103的特异性诱导蛋白;对含此融合表达质粒的酵母转化子半乳糖诱导后表达产物的免疫检测表明,与对照菌株相比,融合表达产物具有和HIV-1阳性血清抗体反应的抗原性.结论 可通过β-半乳糖苷酶活性的测定直接指示抗原片段的表达;为表达的膜糖蛋白片段的进一步分离纯化打下了一定基础.
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SHIV-XJ02170在中国恒河猴体内传代过程中env基因变异研究
目的 研究SHIV-XJ02170在中国恒河猴体内传代过程中env基因序列变异的特点.方法 应用聚合酶链反应(PCR)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别对各代动物SHIV-XJ02170病毒载量峰值时间点全血前病毒DNA gp160基因和血浆病毒RNA gp120基因进行扩增.GP160基因PCR产物直接进行测序分析,gp120 RNA扩增产物连接T载体后每份样品挑选18个克隆测序,分析传代过程中病毒的基因距离(divergence,diversity)的变化规律及病毒基因进化的特点.结果 SHIV-XJ02170在传代过程中基因连续进化并且进化的方向和病毒传代的顺序完全一致,基因距离总体上表现为逐步扩大的趋势,病毒传代早期存在明显的"瓶颈效应".氨基酸序列分析发现V3环顶端四肽和辅助受体在传代过程中未发生改变.结论 SHIV-XJ02170经过中国恒河猴体内传代后基因距离出现明显扩大过程,且按照传代的顺序发生连续的基因进化.这从分子水平上部分解释了 SHIV-XJ02170经猴体传代出现毒力增强的原因.
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1例早期HIV感染者体内病毒准种的各基因片段分析
目的 比较1例早期艾滋病病毒(HIV)感染者体内病毒不同基因片段准种复杂度.方法 使用套式聚合酶链反应(Nested-PCR),扩增HIV感染者外周血淋巴细胞中病毒的gag、pol、vif-vpr和env区的部分基因,通过克隆、测序方法观察该感染者体内病毒准种分布情况,比较不同基因片段检测病毒准种的可靠性.结果 不同基因片段检测病毒准种结果显示,该早期感染者体内的病毒不同基因片段显示的准种基因离散率不同,其中gag区显示出的病毒准种复杂度高,反映为该区段病毒准种的基因离散率高,为0.008;其他各区基因(pol、vif-vpr、env)的离散率依次为0.006、0.001、0.000.结论 该HIV感染者体内病毒准种的基因中,gag区基因的突变率较高,提示Gag在机体感染HIV早期承受的免疫压力较高,因此在病毒准种研究中,gag区应该作为重要的基因区域.
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Env/IFNα-2b融合基因在痘苗病毒中共表达研究
目的本实验选择的真核表达载体pJ16,是以痘苗病毒复制非必需区血凝素(HA)基因为侧翼,以牛痘病毒包涵体(ATI)启动子和串联的p7.5突变型早期启动子为基本构件的痘苗病毒表达载体.插入编码AIDS病毒(HIV-1)外膜蛋白env与编码干扰素IFNα-2b基因.方法经与野生型痘苗病毒在细胞内同源重组,挑选HA-斑.获得重组痘苗病毒vJ16env/IFNα-2b.经免疫荧光、Dot blot、SDS-PAGE、Western blot和免疫小鼠后血清抗体IgG OD值检测.结果vJ16en/IFNα-2b能表达Env-IFNα-2b融合蛋白,分子量约100kDa.免疫小鼠实验,血清抗体IgGOD值组间均数比较(P＜0.001),含IFNα-2b与vJ6env组比较(P＞0.05),但有增高趋势.结论重组病毒表达的Env-IFN融合蛋白具有良好的反应原性和免疫原性.
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HIV-1包膜蛋白ENV慢病毒载体的构建及表达
目的 构建表达HIV-1包膜蛋白ENV的慢病毒载体,感染人胚肾细胞HEK293T,观察env基因在HEK293T中的表达.方法 通过点突变获得HIV-1 env完整基因,将env基因亚克隆至慢病毒穿梭载体pLVX-IRES-ZsGreen1的EcoRⅠ、XhoⅠ位点,构建重组质粒pLV-env,采用脂质体转染法转染HEK293T,经RT-PCR、Western blot检测目的基因表达,同时利用激光共聚焦技术对env基因的表达进行了定位.结果 成功获得了HIV-1 env基因,构建了重组慢病毒质粒pLV-env,RT-PCR、Western blot检测均表明外源基因能够表达,并具有抗原性,同时env基因表达后可以分泌到细胞膜表面膜上.结论 成功构建了含有HIV-1包膜蛋白env基因的重组慢病毒质粒,并验证了其表达,为下一步慢病毒的包装以及细胞模型和动物模型的构建奠定了基础.
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低水平病毒载量长期不进展人类免疫缺陷病毒-1感染者的人类免疫缺陷病毒-1的遗传分析
目的 分析低水平病毒载量长期不进展(LTNP)HIV-1感染者HIV-1的遗传特征.方法 采用有限稀释套式PCR、终点PCR和序列确证分析等技术对5例低病毒载量LTNP HIV-1感染者不同随访时间点HIV-1前病毒enw基因c2-v3-c3区域和gag基因p17区域进行扩增和序列分析.分别计算不同时间点内以及不同时间点与用于分析的早时间点之间上述两个基因区域的基因多样性和基因离散率,依据基因离散率计算基因的进化率,统计学分析用GraphPad Prism 5软件.结果 5例患者在21个随访时间点共获得115条c2-v3-c3序列和173条p17序列.进化树分析表明,不同患者的序列分开,同一患者的序列特异地聚集,序列质量可靠.5例患者env基因c2-v3-c3区域不同时间点基因多样性为0～6.38%,平均为2.1%,病例1、3和5基因多样性随感染时间的增加逐渐升高(r=0.7257、0.4954、0.3288),病例2和4基因多样性随感染时间的增加逐渐下降(r=-0.3759、-0.5028);基因离散率为0.1%～6.5%,平均为2.9%,除病例1外,基因离散率均随感染时间间隔的增加逐渐升高,进化率分别为每年每位点-0.13%、0.81%、0.09%、0.14%和0.16%,平均为0.21%.gag基因p17区域基因多样性为0～2.5%,平均为1.2%,基因离散率为0.2%～2.7%,平均为1.4%,除病例3基因多样性和基因离散率随感染时间或时间间隔的增加下降外,其余病例均随感染时间或时间间隔的增加而逐渐升高,进化率分别为每年每位点0.087%、0.064%、-0.014%、0.081%和0.087%,平均为0.061%.结论 低水平病毒载量LTNP HIV-1感染者HIV-1有复制能力,病毒基因维持较低水平的进化;HIV-1 env基因变化的程度大于gag基因.
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人类免疫缺陷病毒-1的核酸遗传学特点
目的研究人类免疫缺陷病毒(HIV)-1膜蛋白基因(env)的准种与变异特点.方法采用套式聚合酶链反应(PCR)对5例艾滋病患者血浆HIV-1 env基因C2～V3区进行PCR扩增,产物经纯化后克隆至pMD-18T载体中,每例患者分别挑取5～8个克隆,共34株,完成阳性克隆的鉴定、抽提纯化和测序,将获得的DNA序列及核苷酸序列进行分析,并计算其核苷酸同源替换率(ds)与非同源替换率(dn)的比值.结果同一患者体内HIV准种株平均为83.5%,各克隆株之间的核苷酸同源性在88%～99%之间;不同患者之间的核苷酸同源性在75%～91%;34株序列的V3区平均变异频率明显高于C2～C3区(P＜0.05);而V3区和C2～C3区的ds/dn比值均＞1.结论艾滋病患者体内有大量HIV准种存在,基因的变异在V3区发生较频繁,免疫选择压力在该区变异中不起主要作用.
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无锡市艾滋病病毒感染分子流行病学调查
目的 了解无锡市艾滋病病毒感染者和艾滋病患者人群中流行的HIV-1亚型及其分布特征.方法 对无锡市HIV/AIDS人群进行流行病学个案调查,并扩增和测序env部分基因片段,根据env部分基因序列进行病毒亚型分析.结果 有250例HIV/AIDS患者纳入研究,成功扩增并测序203例患者的env基因,共发现6种基因亚型,不同亚型及所占比例分别为流行重组型(circulating recombinant form,CRF) 01 _AE(58.6％,119/203)、CRF07_BC(20.7％,42/203)、CRF15 _01B(9.4％,19/203)、CRF08 _BC(8.4％,17/203)、B(2.0％,4/203)、C(1.0％,2/203),其中CRF01_AE在HIV-1/AIDS患者和男男同性性传播的感染人群中所占比例均高,不同传播途径的病毒亚型分布差异有统计学意义(P＜0.001),系统进化分析显示不同传播途径间存在交叉感染的现象.结论 目前无锡市流行的HIV-1基因型多样,CRF01_AE不仅是HIV/AIDS人群的优势流行毒株,更是男男同性性传播感染者的绝对优势毒株,不同传播途径间的交叉感染现象提示要加强对男男同性性行为人群的管理,密切监测HIV-1基因型及其变异趋势,以更有效地指导艾滋病防治工作.
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广西HIV-1流行株env基因C2V3区序列特征和亚型研究
目的 研究广西艾滋病病毒1型流行株的亚型及env基因C2V3区序列变异特征.方法 2009-2012年共收集138份广西HIV-1感染者血浆样本,提取病毒RNA,用巢式聚合酶链反应对env基因C2V3区序列进行扩增,并测序,用MEGA、HyPhy等软件对序列信息进行分析.结果 138份样本中,CRF01 _AE亚型72例;CRF08_BC亚型40例;B亚型13例;CRF07_BC亚型8例;C亚型2例.各亚型基因离散率分别为:CRF01 _AE(0.052±0.053);CRF08_BC (0.044±0.048);CRF07_BC (0.030±0.041);B亚型(0.024±0.044).各亚型之间基因离散率差异无统计学意义(F=1.260,P=0.291).CRF01_AE的负向选择压力比CRF08_BC大(t=10.060,P＜0.001).共发现7种V3环顶端四肽,其中CRF01_AE有6种,CRF08_BC亚型有2种,两者均以GPGQ为主;B(B')亚型有2种,以GPGR为主,CRF07_BC仅出现了1种.在CRF01_AE亚型和B亚型中分别发现了新的V3环顶端四肽GPGM和GTGR.各亚型辅助受体均主要为CCR5.结论 CRF01_AE亚型在广西HIV-1流行株中占优势,其V3环顶端四肽以GPGQ为主.CRF01_AE亚型和B亚型V3环序列出现了新的变异特征.广西HIV-1流行株主要为巨噬细胞嗜性的非合胞体诱导型.
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1997～2002年山东省HIV-1流行株env基因序列测定和亚型分析
①目的对1997～2002年间山东地区HIV-1各亚型分离株进行基因分型,了解各亚型的分布及其与传播途径的相互关系.②方法采集1997～2002年间山东省38例HIV-1感染者的抗凝全血标本,用巢式PCR技术扩增外周血单个核细胞中HIV-1前病毒env基因C2～V3区,并对C2～V3区的核苷酸序列进行测定和分析.③结果山东省38例HIV-1分离株中存在亚型和重组毒株4种(A、B、C、A/E).其中A亚型5株,B亚型22株(其中包括泰国B亚型11株),C亚型10株,A/E重组毒株1株.各亚型内的离散率有差异,A、B、C亚型内基因离散率分别为1.5%、8.6%和1.9%.在性乱人群和静脉吸毒人群中以A亚型和C亚型为主;在职业献血和不安全血制品使用者中以B亚型为主.④结论 1997～2002年间山东省HIV-1流行特点为A、B、C亚型共存,伴有重组毒株;传播途径复杂,基因变异较大,B亚型仍然为主要流行株.
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受血及献血者HIV-1外膜蛋白ENV基因序列分析
目的了解在广东省受血及献血者中发现的HIV-1亚型的流行规律及其与国际参考株的同源性.方法应用套式聚合酶链反应(PCR)对14例采自于广东省HIV-1抗体阳性的受血者或献血者淋巴细胞富集液的核酸样品进行扩增,并使用AB1377型测序仪对扩增产物测序后,对其ENV基因C2-V3段的核酸序列进行比较分析.结果14份血样中,7份为泰国B'亚型,与国际参考株RL42的距离近,基因离散率为(6.082±2.607)%,组内离散率为(5.963±2.383)%;4份为AE重组亚型,与国际参考株TH.90.CM240近,基因离散率为(8.900±1.830)%,组内离散率为(13.810±1.317)%;2份为07-BC重组亚型,与国际参考株CN.97C54A近,基因离散率为(4.155±1.223)%,组内基因距离为6.36%;1份为08-BC重组亚型,与国际参考株97CNGX-9F近,基因距离为0.97%.结论本次检测的广东省受血及献血者HIV-1以泰国B'亚型为主,也存在主要在性途径感染人群中流行的AE重组亚型和吸毒者中流行的07-BC、08-BC重组亚型.
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山东省HIV-1分离株env基因C2-V3区序列测定
①目的了解山东省l型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的分子流行病学特征.②方法应用套式聚合酶链反应扩增8例HIV-l前病毒基因组的env基因C2-V3区,扩增产物纯化后与pGEM-T载体连接,克隆于大肠杆菌中,提取阳性克隆的重组质粒进行测序,用PHYLIP软件分析核苷酸及氨基酸序列.③结果8株HIV-1毒株V3环顶端的四肽基序均为GPGR,氨基酸变异不显著,各株间基因离散率为1.0%～5.29%,侧翼区碱基的变异频率明显高于V3区,并发现1例毒株出现双V3环现象.④结论山东省的HIV-1分离株以B亚型HIV-1毒株为主,同时发现的双V3环变异现象,可能是HIV-1毒株逃避宿主免疫系统攻击的一种新模式.
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云南瑞丽县IDUs人群HIV-1感染者毒株env基因C2-V3区序列的测定
①目的了解云南瑞丽县1994年以后静脉药瘾(IDUs)人群HIV-1感染者分离株的分子流行病学特征.②方法运用套式聚合酶链反应扩增HIV-1 env基因C2-V3区,将扩增片段纯化后与pEGM5zf(+)载体连接,再克隆入大肠杆菌,提取重组质粒,使用DNA自动测序仪进行序列测定.③结果与此地区1989年分子流行病学资料比较,V3区变异不显著,未发现新的亚型与毒株.④结论 5株HIV-1毒株进化关系非常密切,这一地区IDUs人群中HIV-1的流行毒株仍以美欧HIV-1 SF2株为主.
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1997～2000年我国华东地区HIV-1分离株抗原决定簇氨基酸及其编码核苷酸序列的变化
①目的对1997～2000年来自华东地区52例HIV-1分离株env基因C2～V3区序列及其V3环顶端主要中和抗原决定簇(PND)氨基酸序列的变化规律进行分析.②方法以来自同时期上述地区的HIV-1感染者PBMC基因组为模板,采用套式PCR扩增HIV-1 env基因C2～V3区片段,产物经克隆、测序.DNA测序结果经DNA Star软件分析HIV-1分离株的基因分型,比较HIV-1膜蛋白V3环顶端PND相关八肽氨基酸及其编码核苷酸序列的变化特征及出现频率并测其共享序列.③结果1997～2000年华东地区HIV-1分离株的基因分型有7个,分别属于HIV-1M亚群的A～G亚型.分离株间的基因离散率为1.2%～5.8%.同时发现了env基因双V3区变异的HIV-1自然突变株(Genbank AF220245).分析52株PND相关八肽基因序列,其中以第2、3、7位氨基酸及其编码核苷酸的变化为显著,分别为11.5%、9.6%、9.6%,且3组共享序列相关的八肽亲水性有明显差异.④结论1 997～2000年华东地区HIV-1流行呈现多个型别共同、混合流行的特征,膜蛋白PND的八肽基因序列呈现多样性变化,新的HIV-1膜蛋白双V3区变异株的发现可能与病毒重组、免疫逃避及致病机制有关.
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哈尔滨市新确诊男男同性性接触者HIV-1感染者毒株基因型分析
目的 分析哈尔滨市新确诊男男同性性接触者(men who have sex with men,MSM) HIV-1感染病例的毒株基因型特征.方法 收集2012-2015年新确诊且未经过抗病毒治疗的HIV-1感染者抗凝血,分离外周血单核细胞,从中提取基因组DNA,采用巢式PCR法扩增gag和env基因.采用MEGA7.0软件构建gag和env基因系统发育树,分析基因型特点.结果 共收集148例MSM HIV-1感染者样本,均获得gag和env基因序列.系统发育树显示,其中CRF01_AE亚型108例,占73.0％;B亚型19例,占12.8％;CRF07_BC12例,占8.1％;独特重组型9例,占6.1％.在不同年份、不同年龄群体的标本中,CRF01_AE均为优势基因型.在CRF01_AE毒株中,98.1％ (106/108)与我国MSM人群参考株成簇,1.9％ (2/108)与泰国及我国西南地区异性传播参考株成簇.77.8％ (7/9)的独特重组型毒株来自20～40岁群体.2012年开始出现gag和env基因间重组亚型,2014年发现gag基因内重组亚型,2015年出现基因内和基因间均发生重组的复杂亚型,尚未发现env基因内重组毒株.结论 哈尔滨市2012年至2015年新确诊男男同性性接触人群HIV-1感染病例中流行毒株基因型较复杂,CRF01_AE亚型毒株一直是本地区的优势毒株,同时,基因间和基因内重组毒株已出现.因此,加强MSM人群新发感染病例的实时监测,并制定有效的预防措施是非常必要的.
