人类免疫缺陷病毒1型gp140包膜蛋白三聚体在哺乳动物细胞中的高效表达及其性质鉴定

本研究目的是通过优化1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1) gp140编码基因的密码子和克隆设计,从而实现在293T哺乳动物细胞中高效表达,并对纯化获得的gp140蛋白进行抗原性质鉴定.在本研究中选择HIV-1 B亚型NL4-3全基因序列为模板进行gp140克隆构建,通过密码子优化、信号肽替换、增加柔性1inker、三聚体折叠序列等方法优化设计.通过HIV-1转录反式激活因子tat共转HEK293T细胞进行gp140蛋白表达,采用镍柱纯化.SDS-PAGE、Western blot、ELISA、负染电镜等结果显示目的蛋白纯度高于70％,每升培养基可获得0.5 mg gp140蛋白,并且具有良好的抗原活性,电镜下呈现三聚体结构.通过弗氏佐剂与目的蛋白混合免疫Balb/c小鼠,检测小鼠免疫血清显示gp140蛋白能有效刺激机体产生免疫应答.本研究通过优化表达获得B亚型HIV-1 NL4-3 gp140蛋白,为HIV-1病毒包膜蛋白结构和重组疫苗研究奠定基础.

重庆市 HIV-1慢性感染者亚型交叉反应中和抗体的分析

目的：了解重庆市HIV-1感染者体内亚型交叉中和抗体的水平，并分析其特点，为后续表位研究和HIV-1疫苗研制提供科学数据。方法选取重庆市236份HIV-1慢性感染者为研究对象，采用国际通用的假病毒单复制TZM-bl细胞荧光检测系统，使用多个不同亚型的HIV-1假病毒株交叉筛选，对这些血浆样本进行了中和谱筛查和抗体中和能力（ID50）的检测。结果236份血浆样本中，有18份能交叉中和B和C亚型假病毒，占总样本量的7．63％；其中15份样本对多亚型假病毒表现出不同程度的型交叉中和作用。结论重庆市HIV-1慢性感染者血浆样本中存在HIV-1亚型交叉的广谱中和抗体。

HIV/AIDS患者血清IL-18浓度变化与辅助受体CCR5/CXCR4表达的关系研究

目的 研究人类免疫缺陷病毒/获得性免疫缺陷综合征(HIV/AIDS)患者血清白细胞介质(IL)-18浓度的变化,及其与病毒载量、CD+4T细胞表面辅助受体CCR5/CXCR4表达的相关性.方法 应用酶联免疫吸附试验(ELISA)对42例HIV/AIDS患者及12例正常对照者的血清IL-18浓度进行定量检测,分析其变化,并对其变化与病毒载量的相关性进行分析.应用流式细胞仪检测全部HIV/AIDS患者CD+4T细胞表面辅助受体CCR5/CXCR4的表达情况,并分析其与病毒载量及血清IL-18浓度变化之间的相关性.结果 42例HIV/AIDS患者血清平均IL-18浓度显著高于正常对照组(P＜0.01),且按美国疾病控制与预防中心(CDC)1993年标准,CDC C期显著高于A期(P＜0.01).所有患者血清IL-18浓度变化与HIV病毒载量之间呈正相关(P＜0.05),与辅助受体CXCR4的表达也呈正相关(P＜0.01).HIV病毒载量与辅助受体CXCR4的表达具有正相关性(P＜0.05).结论 HIV/AIDS患者体内持续增长的IL-18加剧了其免疫功能的紊乱和低下,IL-18可能与疾病本身的致病机制有关.

中国HIV-1感染者相关基因SDF1、CCR2b、CCR5多态性分析

目的分析91例中国HIV-1感染人群SDF1、CCR2b、CCR5等位基因型的多态性和分布特点.方法应用聚合酶链反应(PCR)、限制性片段长度多态性(RFLP)分析技术和核酸测序技术分析HIV-1感染人群SDF1、CCR2b、CCR5基因多态性.结果未发现91例中国HIV-1感染者有CCR5△32突变型基因,SDF1-3'A、CCR2b-64I等位基因突变频率分别为26.40%、21.43%,核酸测序结果与PCR/RFLP分析结果一致.结论91例中国HIV-1感染者均为易感者,中国HIV-1感染者SDF1、CCR2b、CCR5不同基因型分布特点,提示,中国人群可能对HIV-1有较大易感性.

陕西省HIV-Ⅰ流行毒株亚型分析

目的 了解陕西省近年来发现的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者所携带毒株的基因序列特征、亚型种类和毒株来源以及在各高危人群中的分布,推断其传播来源和流行趋势,为本省艾滋病防治工作提供技术资料.方法 对HIV感染者进行流行病学相关因素调查,无菌采集HIV感染者抗凝全血,提取前病毒DNA,应用套式聚合酶链式反应(nested-PCR)扩增其膜蛋白基因env,对其C2～V3区及邻区的核苷酸序列进行测定,用GCG软件(Wisconsin 公司)进行亚型分析.结果 35份样本PCR扩增阳性并得到相应序列.经基因离散率计算和系统树分析,共发现4种HIV-1基因亚型和重组毒株,即HIV-1 B'、C、CRF01-AE和CRF-BC重组型.其中泰国B'亚型为主要流行株,占82.35%(28/34),主要来源于既往采供血者及其配偶;其次是CRF-BC重组型,占11.77%(4/34),主要来源于吸毒人群:CRF01-AE和C亚型各1份,分别占2.94%,均来自劳务输出的归国人员.该组样本B'亚型内的基因离散率为5.2%(n=23);而CRF-BC亚型内的基因离散率为0.9%(n=3),彼此间显示出较近的传播关系.结论 陕西省HIV-1流行株以泰国B'亚型为主,发生在与既往有偿采供血相关的地区和人群,已有6～7年的流行史;首次在当地吸毒人群中发现HIV-1 CRF-BC重组型,并且显示近期高度流行的趋势.加强对既往有偿献血人群和吸毒人群的行为干预,控制HIV病毒在家庭内和吸毒人群中的传播,将是今后本省艾滋病防治工作重点之一.

广西HIV-1双阳家庭病毒基因亚型及细胞嗜性分析

目的 了解广西地区HIV-1双阳家庭的病毒基因亚型分布特征,同时分析env基因V3环序列变异特征及其辅助受体使用情况.方法 收集2014—2015年在广西南宁市、柳州市、桂林市、贺州市、钦州市和贵港市共6个市疾病预防控制中心确证为HIV-1感染者的血浆样本,研究对象共来自95个双阳家庭.采用巢式PCR扩增HIV-1 env区基因,利用Sequencher、BioEdit、Mega软件对序列进行拼接、整理和分析.结果 本研究共分析166例HIV-1双阳家庭感染者env基因V3环序列,共发现6种亚型毒株,其中CRF01-AE为146例,构成比大(87.95％);发现2例非流行重组体(URF)0107亚型;对CRF01-AE、CRF07-BC和CRF08-BC三种亚型的基因距离进行分析,发现其基因离散率相差不大.在HIV-1不同亚型毒株的四种gp120 V3环顶端四肽中,主要以GPGQ为主(85.54％);共有110(66.27％)条序列的毒株被预测为使用CCR5作为辅助受体,56条(33.73％)被预测为使用CXCR4作为辅助受体,没有发现R5/X4双嗜性毒株.结论 在广西HIV-1双阳家庭中,流行毒株以CRF01-AE为主;毒株的gp120 V3环顶端四肽以GPGQ为主.广西HIV-1双阳家庭病毒株主要表现为巨噬细胞嗜性的非合胞体诱导型.

应用RFLP技术分析HIV感染相关基因的多态性

目的:评估不同人群对HIV的遗传易感性,为制定艾滋病的预防和控制策略提供科学依据.方法:应用PCR/RFLP技术进行HIV感染相关基因SDF1、CCR2b、CCR5的多态性分析,并用核酸测序技术进行验证.结果:发现PCR/RFLP分析结果与核酸测序结果一致,该方法便于操作、成本较低.结论:可以将PCR/RFLP分析方法应用于HIV感染相关基因多态性的人群分布调查,为今后深入研究中国人SDF1、CCR2b、CCR5各基因型的分布频率打下基础.

2012-2016年四川省广元市HIV-1耐药情况分析

目的 了解2012-2016年四川省广元市新报告未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者的原发性耐药情况和经过抗病毒治疗后HIV-l感染者的抗病毒治疗效果和耐药情况.方法 收集2012-2016年广元地区接受抗病毒治疗1年以上和新报告未治疗的感染者血样,扩增HIV-1 pol基因区,并测序.序列提交斯坦福大学HIV耐药数据库进行耐药位点分析.结果 广元市接受抗病毒治疗的病人数逐年增加,但病毒抑制失败率从4.76％上升到12.93％.而在病毒抑制失败的人群中,因病毒学耐药引起的比例由88.89％下降到了57.69％.接受抗病毒治疗感染者发生的主要耐药突变位点为M184V (88.23％),其次是K65R(29.41％).针对NNRTI主要的耐药突变位点是K103N (37.93％),其次是Y181C(27.59％)和G190A(24.14％).新报告未接受抗病毒治疗的感染者出现的主要原发性耐药位点针对NRTI是K65R和M184V/I,针对NNRTI的是V106A/M.且新报告感染者人群中的原发耐药率近年来增长加快,2016年达到10％.结论 耐药问题是影响抗病毒治疗效果的关键因素之一.在强调规范治疗的同时,应进一步加强耐药的监测和耐药毒株传播的监测.

HIV-1感染过程中CD8+T细胞PD-1水平增高与其活化状态正相关

目的 分析人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者CD8+T细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)、CD38、人白细胞抗原DR(HLA-DR)及KI-67抗原(ki67)的表达水平,探讨HIV-1感染过程中CD8+T细胞PD-1表达水平与免疫活化和免疫耗竭的关系及意义.方法 收集HIV-1感染者87例,健康志愿者22例,密度梯度法分离外周血单个核细胞;采用流式细胞术分析其CD8+T细胞PD-1、CD38、HLA-DR、ki67的表达水平;观察用抗PD-L1 mAb阻断PD-1/PD-L1通路后CD8+T细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)的水平变化.结果 HIV-1感染者CD8+T细胞PD-1表达水平显著高于健康对照组;CD8+T细胞PD-1水平与病毒载量呈正相关,与CD4+T细胞数呈负相关;CD8+T细胞PD-1与CD38、HLA-DR表达呈正相关,与ki67表达无相关性;体外阻断PD-1/PD-L1通路后TNF-α、IFN-γ的表达量增加.结论 HIV-1感染者外周血CD8+T细胞PD-1表达增加;PD-1过表达与HIV感染过程中CD8+T细胞功能受抑、免疫耗竭及疾病进程相关;体外阻断PD-1/PD-L1通路可恢复CD8+T细胞功能.

HIV-1CRF01_AE重组型gp120 V1/V2结构域单克隆抗体的制备与鉴定

目的 真核表达人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1) CRF01_AE重组型gp120蛋白的V1/V2结构域,制备其单克隆抗体并鉴定其抗原反应性.方法 构建pTriEx-3-V1/V2CNE55真核表达载体,在HEK293F细胞中表达V1/V2-His融合蛋白,纯化后作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,ELISA筛选分泌抗V1/V2重组蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤,对单克隆抗体的特异性、型别以及效价进行鉴定.结果 制备并获得一株稳定分泌抗HIV-1 AE亚型V1/V2结构域单克隆抗体的杂交瘤细胞株,ELISA测定腹水效价高达1:81 000,单克隆抗体类型属于IgG1/κ型.Western blot结果表明该单克隆抗体同样能够识别不同亚型的HIV gp120蛋白.结论 成功制备出抗HIV-1 AE重组型gp120蛋白V1/V2结构域的单克隆抗体.

四川省2014年人类免疫缺陷病毒1型耐药警戒线调查

目的 了解四川省开展艾滋病抗病毒治疗后,耐药毒株的传播情况.方法 根据世界卫生组织(WHO)推荐的资源小化人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)警戒线调查方法(HIV drug resistance threshold survey,HIVDR-TS),采集符合调查标准(2014年新报告、未进行抗病毒治疗、16～25岁)的HIV-1感染者的血样53份,扩增HIV-1 pol基因区1.3kb片段,进行基因型耐药分析,用MEGA 5.0软件构建进化树,分析毒株亚型.结果 在53份血样中获得47条有效分析序列,仅1例样本出现针对PR区的次要耐药突变Q58E.病例传播途径以性传播为主,其中同性恋占46.81％ (22/47),异性传播占53.19％ (25/47).进化树分析表明,毒株亚型以CRF07_BC为主(82.98％,39/47),其次为CRF01 _AE (12.77％,6/47),CRF02_AG和CRF08_BC亚型各1例.结论 CRF07_BC和CRF01_AE是四川省16～25岁人群主要的HIV-1流行株.四川省HIV耐药株的传播处于低度水平,这也表明,目前四川省一线药物的治疗方案依然有效.但十分有必要在四川省继续开展连续的传播性耐药情况监测.

HIV-1 DNA疫苗初免-重组痘苗病毒载体疫苗和蛋白疫苗加强策略的免疫原性分析

目的 系统分析人类免疫缺陷病毒(HIV)-1 DNA疫苗初免-重组痘苗病毒载体(rTV)疫苗和蛋白疫苗加强免疫策略在小鼠中诱导的免疫应答反应,为HIV-1疫苗研发提供备选免疫方案和免疫原性评价手段.方法 采用初免-加强策略免疫BALB/c小鼠,ELISA检测特异性结合抗体,流式细胞术检测特异性细胞免疫反应.结果 免疫程序中4个时间点血清样本均可持续检测到广泛的HIV-1特异性抗体(IgG、IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3);rTV疫苗免疫后10d和末次免疫后6周均可检测到HIV-1特异性的细胞免疫反应,分泌细胞因子干扰素( IFN)-γ、白细胞介素(IL)-2和肿瘤坏死因子(TNF)-α;该免疫策略可诱导广泛的三功能性和双功能性T细胞免疫反应.结论 DNA疫苗初免-rTV疫苗和蛋白疫苗加强免疫策略可以在小鼠中诱导出广泛持久的HIV-1特异性体液免疫和细胞免疫应答.

从人类免疫缺陷病毒1型感染者中筛选中和抗体的研究

目的 利用B细胞培养和RT-PCR技术从我国人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者中筛选出具有广谱中和活性的人单克隆抗体.方法 本研究采集HIV-1感染者抗凝全血,分离出外周血单个核细胞,用磁珠分选纯化记忆性B细胞,在体外选择3T3-hCD40L作为饲养细胞,并使用细胞因子白细胞介素(IL)-2和IL-21诱导记忆性B细胞分泌IgG,用HIV假病毒微量中和的方法进行筛选.从有中和活性的孔中分别扩增出B细胞IgG的轻链和重链基因,并将其克隆到含IgG恒定区基因的载体上.然后将携带重链和轻链基因的质粒进行大量表达,得到人单克隆抗体,并进行抗体结合活性、中和活性及与抗原Gp120亲和力的鉴定.结果 从我国3例HIV-1感染者记忆性B细胞中筛选出3株对HIV-1 Env抗原有结合活性的单克隆抗体.其中8E7和55B3主要与Gp120结合,19GF3与Gp120和FLSC均可结合且结合活性无明显差异;基因变异大的8E7抗体对A、B、C三种亚型的假病毒均有一定的中和活性,55B3对SF162有中和活性,19GF3未检测到中和活性;这三种单抗的亲和力都很强,8E7、19GF3、55B3与抗原Gp120的KD值分别为6.45×10-10 mol/L、1.12×10-10 mol/L、2.76×10-10mol/L.结论 成功建立了在96孔板中高效刺激人B细胞在体外分泌IgG的方法,并利用HIV假病毒微量中和实验和RT-PCR技术筛选得到对HIV-1具有中和活性的人单克隆抗体.

哈尔滨市新确诊HIV-1 CRF01_AE亚型nef序列分析

目的 分析哈尔滨市新确诊人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)CRF01_AE亚型nef基因及nef蛋白重要功能区氨基酸的变异性.方法 从56例2014-2015年新确诊感染者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中提取基因组DNA,扩增全长nef基因,并测序.构建nef基因系统发育树,分析基因特点;将nef氨基酸序列与中国和国际CRF01_AE共享序列进行比对,分析nef蛋白重要功能区氨基酸的变异性.结果 56株nef基因序列与不同CRF01_AE亚簇聚集,其中26株与CRF01-4亚簇聚集,24株与CRF01-5亚簇聚集,6株与CRF01-1亚簇聚集.亚簇内基因距离分析发现,CRF01-5亚簇小,CRF01-4亚簇次之,CRF01-1亚簇大.nef蛋白多个功能区氨基酸序列高度保守,但长度可变区、凋亡结构域、酸性区和C端PAK结合区变异率较高,其中凋亡区M50I突变和PAK结合区K192R突变多见于CD4数较低的样本(P＜0.05).结论 哈尔滨市新确诊CRF01_AE亚型nef基因的组成较为复杂,可能来源于多个地区和多种感染途径;凋亡结构域和PAK结合区氨基酸变异与疾病进展相关.

抗人类免疫缺陷病毒1型广谱中和抗体鉴定方法研究进展

哈尔滨市新确诊男男同性性接触者HIV-1感染者毒株基因型分析

目的 分析哈尔滨市新确诊男男同性性接触者(men who have sex with men,MSM) HIV-1感染病例的毒株基因型特征.方法 收集2012-2015年新确诊且未经过抗病毒治疗的HIV-1感染者抗凝血,分离外周血单核细胞,从中提取基因组DNA,采用巢式PCR法扩增gag和env基因.采用MEGA7.0软件构建gag和env基因系统发育树,分析基因型特点.结果 共收集148例MSM HIV-1感染者样本,均获得gag和env基因序列.系统发育树显示,其中CRF01_AE亚型108例,占73.0％;B亚型19例,占12.8％;CRF07_BC12例,占8.1％;独特重组型9例,占6.1％.在不同年份、不同年龄群体的标本中,CRF01_AE均为优势基因型.在CRF01_AE毒株中,98.1％ (106/108)与我国MSM人群参考株成簇,1.9％ (2/108)与泰国及我国西南地区异性传播参考株成簇.77.8％ (7/9)的独特重组型毒株来自20～40岁群体.2012年开始出现gag和env基因间重组亚型,2014年发现gag基因内重组亚型,2015年出现基因内和基因间均发生重组的复杂亚型,尚未发现env基因内重组毒株.结论 哈尔滨市2012年至2015年新确诊男男同性性接触人群HIV-1感染病例中流行毒株基因型较复杂,CRF01_AE亚型毒株一直是本地区的优势毒株,同时,基因间和基因内重组毒株已出现.因此,加强MSM人群新发感染病例的实时监测,并制定有效的预防措施是非常必要的.