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CVB3腺病毒载体疫苗Ad/VP1的构建及免疫小鼠的效果
目的 构建柯萨奇病毒B3(CVB3) VP1基因重组腺病毒疫苗Ad/VP1,并观察其对小鼠的免疫效果.方法 利用AdEasy-1系统构建、包装重组腺病毒Ad/VP1,Western blot法检测目的蛋白的表达.BALB/c小鼠随机分为Ad/VP1、Ad和PBS 3组,肌肉注射免疫,共2次,间隔16d.用ELISA法和微量中和试验法分别检测血清CVB3 VP1IgG和中和抗体滴度；CCK-8法检测特异性CTL杀伤活性；用致死量CVB3攻击小鼠后,检测血巾病毒滴度并观察小鼠的存活率.结果 成功构建、包装了重组腺病毒Ad/VP1,并在293细胞中检测到VP1蛋白的表达.末次免疫小鼠后,Ad/VP1组血清CVB3 VP1 IgG滴度为168.3+1.4、中和抗体水平为31.8±1.4,均明显高于PBS和Ad对照组(P＜0.01),CTL杀伤活性和对小鼠的保护率也高于对照组(P＜0.05),血清病毒滴度低于两对照组(P＜0.05).结论 重组腺病毒疫苗Ad/VP1能显著提高小鼠的细胞和体液免疫应答及免疫保护作用.
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CVB3腺病毒载体疫苗Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用的免疫效果
目的 构建重组腺病毒Ad/MDC-VP1,观察Ad/MDC-VP1与NA疫苗联合应用的免疫效果.方法 构建、包装重组腺病毒Ad/MDC-VP1并检测目的 蛋白的表达.BALB/c小鼠随机分为Ad/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VPl+Ad/MDC-VP1和PBS 4组,肌肉注射免疫小鼠.用ELISA法和微量中和试验法分别检测血清柯萨奇病毒B3(CVB3)VP1 IgG和中和抗体滴度;CCK-8法检测淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击小鼠后,检测血中病毒滴度并观察小鼠的存活率.结果 成功构建并包装了重组腺病毒Ad/MDC-VP1,检测到目的 蛋白的表达.peDNA3/MDC-VP1+Ad/MDC-VP1组血清CVB3 VP1 IsG滴度、淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤活性和对小鼠的保护率明显高于其他各组(P<0.05),血清病毒滴度低于其他各组(P<0.05).结论 Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用能显著提高小鼠细胞和体液免疫应答.
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Aβ3-10多价腺病毒疫苗鼻黏膜免疫BALB/c鼠的免疫原性鉴定及Aβ蛋白表达检测
目的 探讨Aβ3-10多价腺病毒疫苗鼻黏膜免疫BALB/c鼠的免疫原性鉴定及蛋白表达.方法 18只12月龄BALB/c小鼠,随机分为3组,分别为Ad-Aβ(3-10)10-CpG组,空腺病毒载体组和Aβ1-42组,分别以Aβ3-10多价腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻黏膜免疫、空腺病毒载体鼻黏膜免疫、Aβ1-42肌内注射免疫.各组均每2周免疫1次,共免疫6次.ELISA法检测血清抗Aβ抗体滴度及亚型,免疫组化法检测免疫后的BALB/c小鼠抗血清能否与转基因鼠脑内Aβ斑块结合,免疫组化法检测鼻黏膜内Aβ蛋白的表达.结果 Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组抗体滴度随着免疫次数逐渐增加.6次免疫后Ad-Aβ(3-10)10-CpG组血清中抗Aβ抗体滴度为(83.71±16.69) μg/mL,明显高于空载体组(P＜0.01),而低于Aβ1-42组(P＜0.05).Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组的IgG1/IgG2a比值分别为10.85±2.02和1.95 ±1.82,Ad-Aβ(3-10)10-CpG组IgG1/IgG2a比值明显高于Aβ1-42组(P＜0.05).Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组小鼠的抗血清能和转基因鼠脑内的Aβ斑块结合.Ad-Aβ(3-10)10-CpG组鼻黏膜内可以检测到Aβ蛋白表达,而其他各组小鼠鼻黏膜内未检测到Aβ蛋白表达.结论Aβ3-10多价腺病毒疫苗鼻黏膜免疫主要产生Th2型免疫应答,减少了由T细胞介导的免疫应答引起的炎症反应.
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CVB3腺病毒载体疫苗Ad/MDC-VP1的构建及免疫效果研究
目的:构建巨噬细胞源趋化因子(Macrophage-derived chemokine,MDC)与柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)VP1融合基因腺病毒载体疫苗Ad/MDC-VP1,并观察对小鼠的免疫效果.方法:利用AdEasy-1系统构建重组腺病毒Ad/MDC-VP1及腺病毒Ad,并检测融合蛋白MDC-VP1的表达.BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,每组18只,分别肌肉注射Ad/MDC-VP1和Ad,免疫2次,间隔2周.分别用ELISA法和微量中和试验法检测血清CVB3 VP1特异性IgG抗体和中和抗体;末次免疫后3周,CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击后检测小鼠血中病毒滴度并观察保护率.结果:Ad/MDC-VP1和Ad构建成功,并检测到MDC-VP1融合蛋白的表达.Ad/MDC-VP1组血清CVB3 特异性VP1 IgG、中和抗体水平、特异性CTL活性较对照组明显增强(P＜0.01);病毒攻击后实验组血中病毒滴度明显降低,生存率明显高于对照组(P＜0.01).结论:Ad/MDC-VP1能提高小鼠细胞和体液免疫水平,增加病毒攻击后的保护率.
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一种腺病毒载体疫苗的体外生物活性和细胞毒性研究
目的 探讨一个以腺病毒为载体的人用疫苗(代号LMP-Ad)在传代动物细胞株上的表达能力和细胞毒性,为动物试验提供依据.方法 受试物LMP-Ad以不同感染复数(MOI=3000、1000、300、100和30)感染非洲绿猴肾细胞(Veto)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠成纤维细胞(1929)和人胚肺二倍体细胞(KMB17)4种传代细胞株后,用免疫细胞化学染色法检测目的 蛋白LMP在细胞膜上的表达情况;在MOI=3×103、3×104、3 × 103、3×102和30时,用MTT法和FCM检测细胞相对增殖率(RGR)和细胞死亡率.结果 在4种细胞巾均检测到目的 蛋白的表达,其中BHK细胞呈弱阳性,而Vero和KMB17在MOI低至30时仍较好地表达目的 蛋白;随着感染剂量的提高,4种细胞的RGR下降而死亡率上升,其中以Vero细胞的变化为明显.结论 受试物对上述细胞均具生物活性,并在高感染剂量时表现出对细胞的生长抑制和一定程度的损伤,4种细胞以Vero和KMB17对受试物为敏感,更适于作为该类新药的体外研究模型.
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腺病毒载体疫苗在恒河猴体内的长期毒性试验
目的 探讨以5型腺病毒为载体的人用疫苗Ad5-LMP2在恒河猴体内的药效学作用和安全性.方法 恒河猴经im给予4.5×1011、1.5×1011和0.5×1011 v.p·(kg·次)-1的Ad5-LMP2和等体积的磷酸盐缓冲液(对照组),每5 d给药1次,共给药6次.在停药次日和停药15 d时进行尿常规、血液、眼科、心电图、脏器重量和系数、大体观和病理组织学检查;给药前后定期采取猴血清并从剖检猴的脾脏分离淋巴细胞,用ELISA、病毒中和试验和ELISPOT检测腺病毒载体和目的基因蛋白产物LMP2诱导的体液和细胞免疫应答;通过PCR扩增各器官总DNA中的lmp2基因来检测Ad5-LMP2在体内的生物分布.结果 在整个试验期间试验猴均未出现任何异常反应,也无动物死亡;给药组动物在整个给药期间的摄食、饮水和体重增长及上述各项常规毒理学检测中均未出现明显异常.受试物在试验猴体内诱发了较高水平的抗腺病毒中和抗体,但目的蛋白LMP2诱导的特异性细胞免疫应答未受抗腺病毒中和抗体的明显抑制;在猴的心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸(或卵巢)及给药部位均可检测到Ad5-LMP2并维持到停药后15 d.结论 在保证受试物药理学作用的前提下,恒河猴连续1 mon肌肉注射相当人临床拟用剂量37.5倍的Ad5-LMP2,未见明显不良反应,中毒靶器官和中毒剂量未明显显示,其安全剂量大于4.5×1011 v.p·(kg·次)-1.
