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过表达miR-30a抑制BMP9诱导C2C12细胞的成骨分化
目的 探讨miR-30a在BMP9诱导间充质干细胞C2C12成骨分化中的作用.方法 BMP9条件培养基处理间充质干细胞C2C12诱导成骨分化,用real-time PCR连续检测miR-30家族成员的mRNA.用BMP9条件培养基作用Ad-mmu-miR-30a预处理的C2C12细胞,通过ALP染色和活性检测来反映早期成骨指标ALP的表达、分别在mRNA水平和蛋白水平检测中期成骨指标(OCN)的表达、用钙盐沉积来检测晚期成骨分化,用流式细胞术和MTT检测C2C12细胞的周期与增殖.后探讨miR-30a在BMP9诱导C2C12细胞成骨分化中的作用机制.结果 miR-30家族中,只有miR-30a在BMP9诱导C2C12细胞成骨分化中表达下调,miR-30a过表达后,通过靶基因Runx2使BMP9诱导成骨分化能力减弱,ALP的表达下降(P＜0.05),OCN蛋白水平和mRNA水平也都表达下调(P＜0.05),钙盐沉积受到抑制.结论 miR-30a可以抑制BMP9诱导C2C12细胞的成骨分化.
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维生素D对分化中期c2c12细胞的胰岛素信号通路的影响研究
目的：探讨维生素D（VitD）对分化中期的骨骼肌细胞c2c12的胰岛素信号通路的影响。方法用VitD10 nm或是100 nm刺激分化4 d的骨骼肌细胞c2c121 d，细胞回收前进行或不进行5 min的50 nm胰岛素的刺激。Western印迹法测定胰岛素信号通路中细胞外信号调节激酶（ERK）和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）的磷酸化水平。结果 VitD单独处置能够提高ERK的磷酸化水平，并且呈剂量依赖性。其与胰岛素联合处置引起的ERK磷酸化为加和效应；VitD单独处置没有改变AKT的磷酸化水平，与胰岛素联合应用也没有改变胰岛素引起的AKT的磷酸化水平。结论在分化中期的骨骼肌细胞c2c12中，VitD通过加和效应提高了胰岛素信号通路中ERK的磷酸化，但没有影响AKT的磷酸化水平。
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NF-κB在电刺激引起C2C12肌管线粒体功能低下时的作用
目的:探讨NF-κB在不同电刺激状态下C2C12肌管粒体功能低下时的作用.方法:采用TY-C型电刺激器(强度为45 V、20 ms、5 Hz)刺激分化6天的C2C12肌管来建立耐力运动时的神经冲动模型,对照组无任何电刺激,实验组分为刺激即刻组、孵育组和对照组,刺激即刻组的刺激时间分别为60分钟、75分钟、90分钟、120分钟、150分钟和180分钟,孵育组刺激120分钟后放入培养箱中继续培养,时间分别为30分钟、60分钟、120分钟和180分钟.测定各组细胞pIKK-α、NF-κB及MnSOD活性变化.结果:与对照组相比,电刺激即刻组C2C12细胞NF-κB活性显著升高(P＜0.O1),且刺激120分钟和150分钟增加明显(P＜0.05),到180分钟时,略有下降.孵育组中孵育120分钟时NF-κB活性较孵育组其它细胞显著增加(P＜0.01)；与对照组相比,刺激即刻各组细胞内pIKK-α表达显著增加(P＜0.05),但不同时间电刺激各组之间无显著差别.孵育组中,孵育120分钟细胞pIKK-α蛋白表达与孵育组其他细胞相比显著升高(P＜0.01)；与对照组相比,刺激即刻组刺激150分钟时细胞线粒体MnSOD活性显著增加(P＜0.01),孵育组孵育120分钟时C2C12细胞线粒体MnSOD活性显著增加(P＜0.01).结论:(1)在电刺激引起C2C12细胞产生氧化应激,导致细胞线粒体功能的下降中,内源性ROS的产生会激活NF-κB的表达,同时激活IKK-α的磷酸化,且在电刺激强度一定时,NF-κB的活性对电刺激的应答有一定的时相性.(2)随着刺激时间的不同,细胞线粒体MnSOD的活性变化有差异,且线粒体MnSOD活性的变化与刺激时间有关,推测NF-κB的表达上调了细胞内抗氧化物酶MnSOD的表达,这在一定程度上对细胞起到保护作用.
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二氯化钴诱导缺氧对肌细胞萎缩的调控机制研究
目的:探讨二氯化钴(cobaltous chloride,CoCl2)诱导缺氧对肌细胞萎缩的调控机制.方法:本研究采用C2C12小鼠成肌细胞系作为细胞模型,分为正常组、CoCl2组、正常+3-Methyladenine(3MA)组、CoCl2+3MA组.正常组不作处理,CoCl2组加入200 μM CoCl2诱导缺氧,正常+3MA组加入5 mM 3MA,CoCl2+3MA组加入200 μM CoCl2及5 mM 3MA.使用吉姆萨染色观察肌管形态,多功能酶标仪检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)表达,电镜观察自噬体形成情况,实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,QRT-PCR)和免疫印迹技术(western blotting,WB)检测缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、Bcl2/腺病毒E1B 19kDa相关蛋白3(Bcl2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3,BNIP3)、微管相关蛋白1轻链-3 (microtubule associated protein1 light chain 3,LC3) mRNA及蛋白表达;另外,通过抑制自噬观察肌肉萎缩盒F基因(muscle atrophy F-box,MAFbx)蛋白表达的变化.结果:正常组可见长条状肌管形成,CoCl2处理后肌管萎缩、断裂.CoCl2组ROS含量较正常组升高(t=-4.965,P=0.008),电镜可观察到CoCl2诱导自噬体形成,同时HIF-1α、BNIP3、LC3表达增加(P＜0.05).CoCl2与3MA共处理可减少MAFbx蛋白的表达(F=18.246,P=0.001).结论:CoCl2诱导C2C12骨骼肌细胞萎缩,可能与HIF-1α/BNIP3信号通路促进自噬发生有关,抑制缺氧诱导的自噬可部分减少肌萎缩.
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CoCl2预处理对C2C12细胞氧化损伤后增殖和Nrf2表达的影响
目的:采用CoCl2模拟低氧对小鼠骨骼肌卫星细胞(C2C12)进行预处理,探索其对受H2O2损伤C2C12细胞的增殖和Nrf2表达的影响.方法:体外培养C2C12细胞,利用CoCl2模拟化学低氧状态.实验分为对照组、H2O2组和CoCl2预处理组(3 h、6h、12 h、24 h).采用MTr法检测C2C12细胞活性,DCF法测定细胞内活性氧(ROS)含量,Western blot法检测细胞核内Nrf2蛋白含量.结果:(1)CoCl2预处理6h、12 h、24h组细胞活性吸光度均值与H2O2组比较显著增加,具有统计学意义(P＜0.05).(2)CoCl2预处理各组细胞ROS含量均较H2O2组显著下降(P＜0.05).(3)对照组细胞核内Nrf2蛋白含量极少,H2O2组细胞核内Nrf2含量较对照组显著增加(P＜0.05),CoCl2预处理各组细胞核内Nrf2蛋白含量均较H2O2组显著增加(P＜0.05).结论:CoCl2预处理可以保护C2C12细胞免受氧化应激损伤,Nrf2激活可能参与了细胞的抗氧化过程.
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C2C12细胞收缩模型及其收缩功能测定研究进展
骨骼肌收缩功能的强弱直接影响着动物体的运动和捕食能力.C2C12细胞收缩模型的建立,一方面有利于更为方便有效地研究肌肉损伤和药物作用机理,另一方面也是对在体实验的有益补充.近些年来,通过C2C12细胞收缩模型所进行的研究日益增多,其收缩功能的测定方法也不断涌现.本文概述C2C12细胞收缩模型的建立,着重介绍各种测定收缩功能的方法,对各种方法的优缺点进行对比.
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p38MAPK信号通路与应力介导成肌细胞的凋亡
背景:在体内条件下,细胞力学的功能研究因其所处生理环境的复杂性、实验条件的不易控制而很难得到满意结果.目的:在成功构建成肌细胞体外培养-力学刺激模型的基础上,研究p38MAPK信号通路在成肌细胞凋亡中的作用及其机制.方法:将体外培养的C2C12细胞分为对照组和SB203580组,SB203580组中加入 20 mmol/L的p38MAPK抑制剂SB203580.应用细胞应力加载装置Flecell Strain Unit-5000T给细胞提供15%的力值,分别施加0,6,12,24 h的周期性张应力.每分钟10个循环,每循环包括3 s牵张,3 s松弛.Hoechst 33258染色观察细胞的形态学变化;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;RT-PCR法检测促凋亡基因bax mRNA的表达;Western blot检测信号通路中p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表达.结果与结论:随着加力时间的延长,细胞逐渐出现核固缩及凋亡小体,凋亡率增加(P < 0.05),bax mRNA表达增多(P < 0.05);细胞p38MAPK和p-p38MAPK蛋白均在加力6 h达到低,此后逐渐升高.p38MAPK抑制剂SB203580可抑制加力引起的细胞凋亡,减少bax mRNA及p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表达(P < 0.05).说明p38MAPK信号通路在应力介导的成肌细胞凋亡中起到重要的作用.
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核转录因子κB信号通路在应力调控成肌细胞分化中的作用
背景:NF-κB信号通路在细胞生长分化、炎症反应、肿瘤生长等过程中发挥重要的调节作用,也参与成肌细胞分化的调控.目的:分析NF-κB信号通路在应力介导的C2C12成肌细胞分化中的作用及其作用机制.方法:成功构建大鼠C2C12成肌细胞体外培养-力学刺激模型,采用多通道细胞牵张应力加载系统,以0.5 Hz的加载频率和10%的细胞拉伸变形幅度对细胞进行拉伸培养2,6,12,24 h.结果与结论:①C2C12成肌细胞在周期性机械拉伸力作用下,NF-κB信号通路被激活.当细胞受到应力刺激6 h后,胞核NF-κB p65亚基蛋白表达水平开始增强,24 h内NF-κB p65亚基蛋白表达水平达到峰值.加力12,24 h组与未加力对照组之间差异有显著性意义(P < 0.05).②IκBα蛋白表达水平在加力6 h后表达显著下降,24 h内IκBα蛋白表达水平减弱达到低.加力12,24 h组与未加力对照组之间差异有显著性意义(P < 0.05).③周期性张应力促进C2C12成肌细胞分化过程中Myogenin的表达,加入NF-κB信号通路特异性抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸 (20 μmol/L) 后再加力,Myogenin的表达明显降低.以上结果提示:①NF-κB信号通路可能参与应力介导的C2C12成肌细胞分化的调控过程.②当细胞受到应力刺激时,胞质IκBα发生磷酸化并降解.③NF-κB信号通路在应力介导的C2C12成肌细胞分化过程中发挥重要作用,但不是这一调控过程的惟一通路.
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骨形态发生蛋白2诱导成骨分化与长链非编码RNA AK007000的影响
背景：长链非编码 RNA 调控一系列生理过程，被认为在发育、分化和代谢的基因调控中发挥重要的作用。MC3T3-E1、C2C12和 C3H10T1/2细胞可向骨细胞、肌细胞等多个方向分化，用于肌肉骨骼等运动系统相关疾病的研究。
目的：观察长链非编码RNA在骨形态发生蛋白2诱导成骨分化中的作用。
方法：对MC3T3-E1、C2C12和C3H10T1/2细胞在骨形态发生蛋白2诱导下，成骨分化过程中的长链非编码RNA表达变化进行芯片分析，找到在3株细胞中同时变化的长链非编码RNA，siRNA干扰方法观察长链非编码RNA对骨形态发生蛋白2诱导成骨分化的影响，采用Real-Time PCR与碱性磷酸酶染色检测成骨相关指标。
结果与结论：骨形态发生蛋白2诱导MC3T3-E1、C2C12和C3H10T1/2成骨分化过程中，相应成骨指标增高，成肌指标肌细胞生成素降低。筛选出骨形态发生蛋白2诱导成骨分化过程中出发挥作用的长链非编码RNA AK007000。AK007000被干扰后成骨分化指标碱性磷酸酶、骨钙素、RUNX2、SP7表达下降，肌细胞生成素表达上升。因此，AK007000可能具有促进成骨抑制成肌作用。 -
骨形态发生蛋白2诱导C2C12和MC3T3-E1的成骨分化与自噬
背景：一系列研究表明自噬与分化有密切联系；骨形态发生蛋白2是诱导C2C12、MC3T3-E1成骨分化经典途径，是研究成骨分化过程的理想模型。
目的：观察自噬与骨形态发生蛋白2诱导细胞株C2C12、MC3T3-E1成骨分化的关系。
方法：Real-Time PCR检测MC3T3-E1与C2C12在骨形态发生蛋白2(100μg/L)诱导培养3 d后成骨与自噬相关指标变化。碱性磷酸酶染色检测不同浓度3-甲基腺嘌呤(0，1，5，10 mmol/L)对骨形态发生蛋白2(100μg/L)诱导培养7 d MC3T3-E1与C2C12成骨指标碱性磷酸酶变化，Western Blot检测C2C12和MC3T3-E1在骨形态发生蛋白2(100μg/L)诱导不同时间点(0，12，24，48，72，96 h)LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表达水平。
结果与结论：在骨形态发生蛋白2诱导细胞株 C2C12、MC3T3-E1成骨分化过程中，诱导自噬相关 mRNA与蛋白水平均有增高趋势，且自噬相关蛋白LC3水平增高与时间相关。同时，抑制自噬成骨分化过程中碱性磷酸酶表达水平降低。因此，自噬与骨形态发生蛋白2诱导细胞株C2C12、MC3T3-E1成骨分化过程有密切关系。 -
miRNA138体外抑制C2C12细胞纤维化研究
目的 探讨转化生长因子-β1 (TGF-β1)诱导小鼠成肌细胞C2C12建立体外纤维化模型,观察miRNA138含量改变对细胞纤维化指标的影响,分析miRNA138对细胞纤维化的影响是否通过其靶基因Smad4实现.方法 设计并合成miRNA138-mimics、miRNA 138-inhibitor、miRNA138-NC,经脂质体转染至C2C12细胞,转染后细胞再经TGF-β1 (10 ng/mL)诱导48 h;Real-time PCR检测胞内miRNA138表达,Western blotting检测胞内纤维化相关蛋白Smad4 、vimentin、α-SMA及collagen Ⅰ表达变化,确认纤维化模型是否成功建立并分析胞内miRNA138表达改变对细胞纤维化指标的影响;CCK-8法检测miRNA138表达改变对纤维化过程中C2C12细胞增殖活性的影响;生物信息学分析miRNA138与Smad4理论结合位点并通过荧光素酶报告基因实验进行验证;构建Smad4基因表达载体,并与miRNA138-mimics共转染C2C12细胞,转染后细胞再经TGF-β1诱导发生纤维化,Western blotting检测细胞纤维化相关蛋白变化,分析外源Smad4表达对于miRNA138抑制细胞纤维化作用的影响.结果 miRNA138-mimics转染C2C12细胞后细胞内miRNA138表达明显上升;miRNA138-inhibitor转染后,C2C12细胞内miRNA138表达下降;转染对照组细胞内miRNA138表达无明显变化;蛋白检测结果显示:TGF-β1诱导C2C12细胞48 h,胞内Smad4、vimentin、α-SMA和collagenⅠ蛋白表达均明显升高,细胞对数生长期增殖活性明显增强,表明细胞纤维化模型成功建立;细胞内miRNA138过表达明显抑制了C2C12细胞纤维化;荧光素酶活性检测数据显示,miRNA138与Smad4的预测靶位是客观存在的;在C2C12细胞内高表达外源Smad4基因,可明显减弱miRNA138-mimics对细胞纤维化相关蛋白的抑制作用.结论 miRNA138可以抑制TGF-β1诱导的C2C12细胞纤维化,是通过抑制其靶蛋白Smad4表达实现的.
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Myostatin干扰质粒的构建及在C2C12细胞中的效果验证
目的:研究Myostatin干扰质粒在小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12细胞中的沉默作用.方法:根据Myostatin mRNA序列,选择3个19nts的靶序列,设计并合成包含各正反义靶序列的互补DNA链以及1个无干扰作用DNA链,退火后插入pSilencer2.1-U6表达载体,构建3个RNAi阳性质粒:M1/pSilencer、M2/pSilencer、M3/pSilencer及一个阴性质粒Mc/pSisencer并转染C2C12细胞,采用实时荧光定量PCR和Western blot观察RNAi对C2C12细胞中Myostatin mRNA和蛋白表达的下调作用.结果:构建的3个阳性干扰质粒中M1/pSilencer能显著降低C2C12细胞中Myostatin表达量,随着M1/pSilencer干扰质粒剂量的增加,Myostatin表达量逐渐降低.结论:成功构建Myostatin RNAi质粒,该质粒能下调目的基因Myostatin在C2C12细胞中的表达量.
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应力加载对体外培养C2C12细胞自身抗原及TLR3的影响
目的 探讨机械应力加载是否干扰体外培养C2C12成肌细胞自身抗原及TLR3的转录表达. 方法 对生长于BioFlex柔性基底膜表面的C2C12细胞施加不同频率的拉伸加载,流式细胞术分析细胞增殖情况.Real-time RT-PCR检测并比较分析应力加载前、后骨骼肌自身抗原(HRS、Mi-2、U1-70、DNA-PKcs)、TLR3的mRNAs表达差异. 结果 0.25 Hz、10％幅度、2 h/d的拉伸条件能加速C2C12细胞进入细胞周期.2d和4d拉伸组DPI较对照组提高(P＜0.05),尤以2d拉伸组细胞增殖为显著.拉伸2d时,C2C12细胞内HRS、Mi-2、U1-70、DNA-PKcs以及TLR3的mRNA水平均显著低于同一培养时间的对照组(P＜0.05).结论 机械应力刺激信号可能参与下调与骨骼肌组织炎症相关的免疫调节分子.
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Nec-1 对模拟缺氧条件下骨骼肌细胞损伤修复的作用研究
目的 探讨Necrostatin-1 (Nec-1 )在二氯化钴(CoCl2)诱导缺氧的条件下对骨骼肌细胞损伤修复的保护作用.方法 采用小鼠骨骼肌C2C12 成肌细胞为体外模型,CoCl2诱导缺氧,Nec-1为缺氧保护剂.将培养分化72 h 后的细胞分为4组,分别加入等量培养基(Control 组)、200 μM CoCl2(CoCl2组)、150 μMNec-1(Nec-1 组)、200 μMCoCl2+150 μMNec-1(CoCl2+Nec-1 组),于光镜下观察不同处理组细胞的肌管形态,采用蛋白免疫印迹技术检测肌细胞生成素(Myog)、肌细胞增强因子2A(MEF2A)蛋白表达的变化,统计细胞周期S期比例,划痕实验观察细胞的损伤修复能力.结果 CoCl2可诱导肌细胞形态异常,减少肌管分化,与Control组比较,CoCl2组Myog、MEF2A蛋白表达量降低(P均 ＜0. 01 ),同时,S 期细胞比例下降(P＜0. 01 ),划痕面积修复能力下降(P均 ＜0. 01).加入Nec-1 干预后,细胞形态恢复,肌管分化增多,与CoCl2组比较,CoCl2+Nec-1 组Myog、MEF2A蛋白表达量及S期细胞比例上调(P均＜0. 05 ),细胞划痕面积恢复(P＜0. 05 ).结论 CoCl2模拟缺氧可抑制肌细胞增殖、分化功能,导致肌细胞损伤修复能力下降.Nec-1 可增强缺氧条件下肌细胞的增殖和分化能力,对肌细胞的损伤修复有保护作用,可能通过抑制程序性坏死来促进肌细胞的损伤修复.
关键词： 二氯化钴 缺氧 C2C12 necrostatin-1 损伤修复 -
微小RNA分子miR-21和miR-22对C2C12细胞成肌分化影响的研究
目的 探讨微小RNA(microRNAs)分子miR-21和miR-22对于C2C12细胞体外成肌分化进程的影响.方法 以C2C12细胞体外成肌分化为模型,Northern blot检测miR-21和miR-22两个分子在分化过程中的表达变化及组织表达谱,转染DNA/LNA杂合体反义链进行loss-of-fuction功能研究,RT-PCR分析其对分化相关分子的影响.结果 成功建立C2C12细胞体外成肌分化模型,2个分子在分化过程中均表达上调,且它们具有各自的组织分布特点；建立了以DNA/LNA杂合体反义链为手段的microRNAs研究的loss-of-fuction平台；与对照组比较,抑制这2个microRNAs对于成肌分化相关的骨骼肌α-肌动蛋白、成肌素和MEF-2D等分子的表达没有影响.结论抑制miR-21和miR-22在C2C12细胞成肌分化过程中的上调不影响其分化,说明这2个分子对于分化的进程影响不大.
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体外炎性环境下小鼠成肌细胞/分化肌管的免疫特性研究
目的 对体外炎性环境下小鼠成肌细胞/分化肌管的免疫学特性进行检测,分析其是否具备抗原呈递功能.方法 用IFN-γ刺激小鼠成肌细胞(C2C12)及马血清诱导分化后的肌管,通过免疫荧光染色、q-PCR、Western blot、流式细胞术检测细胞表面H-2kb、MHC-Ⅱ、TLR3及相关细胞因子水平的改变.结果 IFN-γ刺激后,免疫荧光染色、q-PCR、Western blot均检测到成肌细胞/分化肌管表面MHC分子表达上调,Western blot检测到TLR3表达上调,q-PCR检测到细胞因子IL-1β、IL-6、IL-I0、IL-18、MCP-1及TGF-β表达上调.结论 在炎性条件下,成肌细胞/分化肌管具备炎性细胞表征,具备抗原呈递功能.
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绿色荧光蛋白和成肌调节因子在骨髓基质干细胞中的共表达
目的:研究重组腺病毒(Ad)对骨髓基质干细胞(MSCs)的转染,以及绿色荧光蛋白(GFP)和成肌调节因子MyoD和Myogenin在MSCs中的表达. 方法:用差速贴壁法体外培养大鼠MSCs,并用流式细胞仪(FCM)检测其表面标志;对构建有绿色荧光蛋白的重组腺病毒(Ad-GFP)进行扩增和鉴定,并转染MSCs;用RT-PCR检测MyoD和Myogenin在转染后MSCs中的表达;将MSCs与C2C12成肌细胞共培养,诱导前者的分化,并用免疫荧光检测MyoD的表达. 结果:FCM检测证实,在MSCs的表面标志中CD11b和CD45阴性,而CD29和CD44阳性;随着Ad-GFP感染复数(MOI)的增加,转染效率也相应提高,但在MOI大于100后,MSCs开始出现病变;RT-PCR结果提示MyoD和Myogenin在转染后的MSCs中有表达;免疫荧光检测证实诱导后的MSCs可以表达MyoD蛋白. 结论:MSCs可以被Ad-GFP有效转染而表达GFP;同时内源性成肌调节因子的激活,可以促进MSCs的成肌分化.
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肌酸补充与运动能力
大量研究表明,运动员可以通过补充肌酸提高肌肉中磷酸肌酸的再合成进而可以增加力量和速度.本文结合近年来国内外对肌酸的研究概况,以文献综述的形式来进一步论述肌酸与运动能力的关系.
关键词： 肌酸运动能力 C2C12 骨骼肌成肌细胞运动营养
