Necroptosis is characterized by programmed necrotic cell death and autophagic activation and might be involved in the death process of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. We hypothesized that necrostatin-1 could block necroptosis and give protection to dopaminergic neurons. There is likely to be crosstalk between necroptosis and other cell death pathways, such as apoptosis and autophagy. PC12 cells were pretreated with necroststin-1 1 hour before expo-sure to 6-hydroxydopamine. We examined cell viability, mitochondrial membrane potential and expression patterns of apoptotic and necroptotic death signaling proteins. The results showed that the autophagy/lysosomal pathway is involved in the 6-hydroxydopamine-induced death pro-cess of PC12 cells. Mitochondrial disability induced overactive autophagy, increased cathepsin B expression, and diminished Bcl-2 expression. Necrostatin-1 within a certain concentration range (5–30 μM) elevated the viability of PC12 cells, stabilized mitochondrial membrane potential, inhibited excessive autophagy, reduced the expression of LC3-II and cathepsin B, and increased Bcl-2 expression. These findings suggest that necrostatin-1 exerted a protective effect against injury on dopaminergic neurons. Necrostatin-1 interacts with the apoptosis signaling pathway during this process. This pathway could be a new neuroprotective and therapeutic target in Par-kinson’s disease.

程序性坏死参与铝致神经母细胞瘤细胞死亡机制

目的 探讨程序性坏死(necroptosis)在铝致神经细胞死亡中的作用,以完善铝致神经细胞死亡的机制研究.方法 用4 mmol·L-1 AlCl3·6H2O染毒神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y制作铝致神经细胞死亡模型,用RNA干扰技术(RNAi)抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3基因的表达;用程序性坏死的特异性阻断剂necrostatin-1(Nec-1)抑制程序性坏死的产生.检测不同处理、处理后不同时间点细胞的活力变化,荧光定量PCR法检测RNAi效率,流式细胞仪检测细胞的凋亡率及坏死率改变,免疫组织化学法检测蛋白表达量的差异.结果 通过细胞活力在不同小干扰RNA(siRNA)序列、不同转染剂量、不同作用时间点的变化,找到其适转染浓度为10 nmol·L-1,适作用时间为转染后48 h.通过RNAi抑制caspase 3基因表达的差异,筛选出有效序列为caspase 3 siRNA 1序列;荧光染色并观察计数表明caspase 3 siRNA的转染效率为93.0%, 其干扰效率为63.0%, 对caspase 3蛋白表达有显著的阻抑效应. Caspase 3 siRNA单独作用于染铝SH-SY5Y细胞,可以显著提高细胞活力,降低其凋亡率;Nec-1单独作用于染铝SH-SY5Y细胞可以显著提高其细胞活力,降低细胞坏死率;共同作用在染铝SH-SY5Y细胞时两者有增强作用,可以显著提高细胞活力,并同时降低SH-SY5Y细胞的凋亡率及坏死率.结论 在铝致神经细胞死亡的机制中,除了传统上认为的凋亡和坏死途径外,还有程序性坏死的存在.

z-VAD-FMK与Necrostatin-1联合对MODS大鼠器官的保护作用研究

目的:探讨z-VAD-FMK与Necrostatin-1联合对MODS大鼠器官的保护作用.方法:采用失血性休克-内毒素“二次打击”建立大鼠MODS动物模型.将80只雄性SD大鼠随机分为4组:z-VAD-FMK组、Nec-1组、z-VAD-FMK+Nec-1组、模型组,每组20只,观察72 h死亡率.另取40只雄性SD大鼠随机分为5组:假手术组、z-VAD-FMK组、Nec-1组、z-VAD-FMK+Nec-1组、模型组,每组8只,分别于注射内毒素和生理盐水后24 h收集血清和肝、肺、肠组织.全自动生化仪检测血清ALT、AST的变化,血气分析仪检测PaO2的变化,ELISA检测血清TNF-α、IL-1β的变化,HE染色观察肝、肺、肠组织的病理学改变.结果:大鼠遭受失血性休克-内毒素“二次打击”后,血清ALT、AST明显升高(P＜0.01),PaO2显著下降(P＜ 0.01),血清炎性因子TNF-α、IL-1β水平明显升高(P＜0.01).光镜下见肝窦明显扩张、淤血,肝小叶结构紊乱,肝细胞部分变性、坏死;肺泡壁结构被破坏,肺间质充血,大量炎性细胞浸润;肠绒毛结构被破坏,部分绒毛顶部细胞、隐窝细胞变性、坏死,大量炎性细胞浸润.而z-VAD-FMK组、Nec-1组及z-VAD-FMK+Nec-1组ALT、AST升高程度、PaO2下降程度、TNF-α、IL-1β升高程度均显著低于模型组(P＜0.01),以z-VAD-FMK+Nec-1组变化明显.72 h死亡率均较模型组显著降低(P＜0.05).结论:z-VAD-FMK、Nec-1、z-VAD-FMK+Nec-1联合治疗均可显著减轻MODS大鼠的器官损伤,联合治疗效果更佳.

脑缺血后程序性坏死的形态学观察及necrostatin-1的保护作用

目的:观察脑缺血后损伤区发生程序性坏死(necroptosis)的细胞学变化规律,并探讨necrostatin-1(Nec-1)的保护作用.方法:雄性C57BL/6小鼠,随机分为假手术组、模型组和Nec-1给药组,建立小鼠永久性大脑中动脉阻塞模型,用在体碘化丙啶(PI)染色标记坏死细胞,并分别与NeuN、GFAP和Iba-1双标以判断坏死细胞类型,用免疫电镜观察磷酸化MLKL(pMLKL)的分布,用免疫印迹检测各组损伤区pMLKL的表达情况.结果:脑缺血模型后6h损伤区即出现PI阳性细胞,术后1～3 d达到多,80％与NeuN共标;术后7d时,PI阳性细胞明显减少,主要与GFAP和Iba-1共标;免疫电镜显示脑缺血后3d时pMLKL的胶体金颗粒主要沉积于神经元,而术后7d时主要分布在星形胶质细胞和小胶质细胞.免疫印迹结果显示,模型组损伤区pMLKL的表达较对照组明显升高;与模型组相比,Nec-1给药组pMLKL的表达量明显下降.结论:脑缺血后损伤区随时间变化有不同程度的细胞程序性坏死,Nec-1通过对抗程序性坏死发挥神经保护作用.

LC-MS/MS法测定细胞程序性坏死抑制剂Necrostatin-1大鼠血浆浓度及其应用

目的 采用LC-MS/MS法测定大鼠血浆中Necrostatin-1的浓度,并应用于大鼠体内药动学研究.方法 血浆样品经乙腈蛋白沉淀法处理后进行分析.采用SB-C18色谱柱(50mm×2.1 mm,1.8 μm),以乙腈-水(含0.1％甲酸)为流动相进行梯度洗脱,流速为0.4 mL·min-1,正离子多离子反应监测(MRM)检测.用于定量分析的离子对为m/z 260.1→131.0(Ne-crostatin-1)和285.1→192.9(内标:地西泮).结果 Necrostatin-1的线性范围为4～ 2500 μg· L-1,低定量下限为4μg·L-1;提取回收率为85.49％～93.21％,基质效应为93.25％～101.11％;日内、日间RSD均＜10％,血浆样品室温放置6h、3次冻融循环以及低温(-70℃)储存2周稳定.Necrostatin-1的药动学参数t1/2为1.89 h.结论 本方法学符合生物样品分析要求,可用于大鼠血浆N ecrostatin-1药物浓度的测定及其药动学研究.

Necrostatin-1对输尿管梗阻小鼠肾脏炎症的影响

目的 探讨necroptosis(坏死性凋亡)抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)对单侧输尿管梗阻(unilateral ureter obstruction,UUO)小鼠肾脏炎症的影响.方法 雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(Sham组)、左侧输尿管结扎组(UUO组)、UUO+ Nec-1治疗组(UN组),术后7天处死小鼠取左肾.收集血清测定肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平;HE染色观察肾脏形态学改变;免疫组化法和Western blot法分别检测肾脏组织中坏死性凋亡相关指标RIP1、RIP3、MLKL以及炎症相关因子TNF-α、IL-1β、MCP-1的表达.结果 与Sham组相比,UUO组小鼠RIP1、RIP3和MLKL蛋白表达明显升高,同时伴有TNF-α、IL-1β、MCP-1表达增多.Nec-1治疗显著降低了上述蛋白的表达水平,同时HE染色显示肾间质炎性反应和肾小管损伤程度有所减轻,Scr和BUN水平提示肾功能有所改善.结论 Nec-1通过抑制necroptosis减轻了单侧输尿管梗阻小鼠肾脏的炎症反应,这可能成为治疗肾脏继发炎症的新靶点.

Necrostatin-1对雨蛙肽诱导的小鼠急性胰腺炎的保护作用

目的 观察Necrostatin-1(Nec-1)对雨蛙肽诱导的小鼠急性胰腺炎(AP)的影响.方法 C57BL/6小鼠予以50 μg/kg的雨蛙肽腹腔注射7次,间隔1h,建立AP模型.于第1次雨蛙肽注射后3h、6h、9h和12h,取出胰腺组织,HE染色.Western blot检测RIP1和RIP3蛋白的表达;C57BL/6小鼠随机分为:Control组、Vehicle组、Nec-1组和Nec-li组,予以50 μg/kg的雨蛙肽腹腔注射10次,间隔1h,第1次雨蛙肽注射2h前,腹腔注射Nec-1(1mg/kg,每6h1次)、Nec-li或等体积溶剂和空白对照 于第1次雨蛙肽注射后12 h、18 h和24 h,收集血清和胰腺组织.检测血清淀粉酶和脂肪酶.HE染色评估胰腺损伤程度.Real-time RT-PCR检测胰腺组织IL-1 β和TNF-α mRNA的表达.结果 RIP1和RIP3蛋白在雨蛙肽诱导的AP中逐渐升高,且与胰腺腺泡细胞的坏死呈正相关;应用Nec-1后,与Vehicle组和Nec-li组比较,于12h、18 h和24 h,小鼠血清淀粉酶和脂肪酶水平明显降低,胰腺组织病理评分也明显减少,同时胰腺组织中IL-1β和TNF-α mRNA的水平也明显降低.结论 Nec-1对实验性胰腺炎具有明显的保护作用;程序性坏死可能促进了急性胰腺炎的损伤.

Necrostatin-1在小鼠脊髓损伤后继发性损伤中的作用

目的 探讨Necrostatin-1(Nec-1)在小鼠脊髓损伤后继发性损伤中的作用及机制.方法 将168只健康成年雌性LCR小鼠随机分为4组:对照组(48只)、脊髓损伤组(48只)、溶剂组(36只,鞘内注射4 μl二甲基亚砜)和治疗组[36只,鞘内注射4 μl Nec-1(4 mmol/L)].采用血管夹钳夹小鼠脊髓建立脊髓损伤模型.伤后6、12、24、48 h采用免疫印迹法检测脊髓组织受体相互作用蛋白(RIP)1、3的表达;伤后24 h采用免疫共沉淀法评估RIP1和RIP3的相互作用;伤后24 h检测脊髓组织丙二醛(MDA)和活性氧簇(ROS)水平,电镜观察小鼠脊髓组织神经元线粒体损伤情况.结果 伤后48 h内,小鼠脊髓RIP1表达水平无明显变化;伤后6 h,小鼠脊髓RIP3表达水平明显增高,持续到伤后48 h.伤后24 h,治疗组和溶剂组RIP1和RIP3的表达水平均无明显差异;正常脊髓组织RIP1和RIP3相互作用较弱,脊髓损伤后RIP1和RIP3相互作用加强,而Nec-1显著抑制RIP1和RIP3相互作用.伤后24 h,脊髓神经元线粒体不同程度受损,而治疗组小鼠脊髓神经元线粒体结构保存相对较好.伤后24 h,脊髓组织MDA和ROS含量明显升高,而Nec-1能明显减少小鼠脊髓MDA和ROS含量.结论 小鼠脊髓损伤后,Nec-1通过抑制RIP1和RIP3的相互作用,进而抑制程序性坏死,减轻脊髓继发性损伤.Nec-1能降低ROS产物,减轻氧化应激损伤,保护线粒体功能.

Necrostatin-1对小鼠脑外伤脑组织损害及行为学能力的影响

目的 探讨细胞程序性坏死特异性抑制剂Necrostatin-1 (Nec-1)对脑外伤导致的组织损伤和行为学能力(运动功能、学习能力)损害的影响.方法 健康成熟雄性昆明小鼠(体重20～25 g),采用改良的自由落体装置制作定量右侧脑外伤(Traumatic Brain Injury,TBI)模型,建模15 min前同侧脑室分别注射溶剂二甲基亚砜(DMSO)和DMSO配制的Nec-1溶液分别建立脑外伤DMSO组和脑外伤Nec-1组,同时设立假手术组(Sham组),利用行为学试验(Motor Test和Morris水迷宫试验)评估TBI2周内各组小鼠的运动功能和学习能力损害,利用脑组织缺损体积(Lesion Volume,LV)评价TBI 3周后脑皮质损伤程度.结果 (1)脑外伤后1周内能观察到小鼠运动能力评分降低明显(P＜0.01),伤后2～7 d各组运动评分均逐渐恢复.与DMSO组比较,Nec-1预给药能明显加快运动功能的恢复过程(P＜0.05);(2)所有TBI小鼠与Sham组比较,在水迷宫定位航行试验中搜找平台时需要更长的潜伏期(P＜0.05);Nec-1组在伤后第9～12 d表现较短的潜伏期(P＜0.05);(3)脑外伤导致各组小鼠脑组织的缺失(P＜0.01),与DMSO组比较,Nec-1预处理明显减少了脑外伤后的脑组织损伤体积(P＜0.05).结论 侧脑室预注射Nec-1抑制程序性坏死可减少小鼠脑外伤后脑组织缺损,促进活动功能、学习能力的恢复.

人肾小管上皮细胞necroptosis模型的构建

目的:以体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)为靶细胞,构建肾小管上皮细胞凋亡样坏死(necroptosis)的模型.方法:采用肿瘤坏死因子α(tumor nercosis factor α,TNF-α)诱导细胞凋亡,同时采用抗霉素A(antimycin A)耗竭ATP,构建肾小管上皮细胞凋亡的模型,并以caspase-8抑制剂苄氧羰酰-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-氟甲基酮(benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone,zVAD-fmk)阻断凋亡,用necroptosis的特异性抑制剂necrostatin-1(Nec-1)阻断necroptosis,观察细胞在不同的处理下形态学的变化,同时检测细胞存活率及标志物微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)的表达.结果:(1)在TNF-α+zVAD- fmk+antimycin A处理1 h时细胞及细胞器膨胀,电镜下细胞膜碎裂,线粒体变圆、肿胀,嵴逐渐模糊,胞浆中出现大量自噬小体,而Nec-1预处理后细胞的坏死程度较对照组明显改善.(2)在TNF-α+zVAD-fmk+antimycin A 1 h实验组,Nec-1预处理后细胞的存活率显著增加(P<0.05).(3)TNF-α+zVAD-fmk+antimycin A干预1 h实验组在Nec-1预处理后LC3-Ⅱ的表达量明显下降(P<0.05).结论:凋亡环境中阻断凋亡可以诱导肾小管上皮细胞necroptosis,抑制剂Nec-1能特异性阻断肾小管上皮细胞发生坏死.

自噬对肾大部切除大鼠肾小管上皮细胞程序性坏死的影响

目的：探讨自噬是否参与肾大部切除（ SNx）大鼠肾小管上皮细胞的过度死亡，及其与程序性坏死的关系。方法：48只雄性SD大鼠随机分为control组（6只）和SNx组（42只），分别行假手术和SNx。将24只SNx大鼠分为0、4、8和12周组；其余SNx大鼠分为SNx＋vehicle组、SNx＋necrostatin－1（ Nec－1）组和SNx＋3－甲基腺嘌呤（3－MA）组，每组6只。检测0、4、8和12周组大鼠肾组织RIP1、RIP3、LC3和beclin－1的mRNA和蛋白表达水平；用Nec－1和3－MA干预SNx大鼠，Western blot法检测LC3－Ⅰ、LC3－Ⅱ和beclin－1的蛋白水平，透射电镜和TUNEL染色判定Nec－1和3－MA对SNx大鼠肾小管上皮细胞死亡的影响，并观察Nec－1和3－MA对SNx大鼠肾组织的病理变化、活性氧簇（ROS）、血尿素氮（BUN）和血肌酐（SCr）含量的影响。结果： SNx术后8周大鼠肾组织RIP1、RIP3、LC3和beclin－1的mRNA和蛋白水平达高值（ P＜0．01）；Nec－1和3－MA干预SNx大鼠的LC3－Ⅱ／Ⅰ和beclin－1蛋白水平、发生程序性坏死的肾小管上皮细胞及TUNEL阳性细胞数量均显著降低（P＜0．01）。另外，Nec－1减低SNx大鼠肾组织的ROS含量，但3－MA无此作用。结论：自噬参与了SNx大鼠肾小管上皮细胞过度死亡；抑制自噬可减轻SNx大鼠肾小管上皮细胞程序性坏死及其肾损伤。

Necrostatin-1对大鼠脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞和炎症因子的影响

目的 探讨干预程序性坏死途径对大鼠脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞活化及相关炎症因子的影响及意义. 方法 采用改良线栓法构建大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型.(1)SD大鼠按随机数字表法分为脑缺血再灌注6h组、脑缺血再灌注12h组、脑缺血再灌注24 h组、脑缺血再灌注72h组,每组6只.免疫组化染色检测不同时间点小胶质细胞激活标志离子型钙接头蛋白-1(iba-1)的表达,根据实验结果选取iba-1表达相对明显的时间点.(2)SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、脑缺血再灌注组、Necrostatin-1 (Nec-1)(80 nmol)干预组、Nec-1 (160 nmol)干预组,每组6只,并于脑缺血后2h给予Nec-1干预.采用Longa法进行神经功能损伤评分、TTC法检测梗死体积,根据实验结果选取Nec-1干预的适宜给药剂量.(3)SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、脑缺血再灌注组、溶剂组、Nec-1干预组,每组6只,并于脑缺血后2h给予Nec-1或DMSO溶剂干预.HE染色观察梗死周围组织神经元存活情况,免疫组化染色检测梗死周围组织iba-1的表达,免疫组化染色及Western blotting分别检测炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、胶质源性神经营养因子(GDNF)免疫阳性细胞及蛋白的表达. 结果 (1)iba-1表达在脑缺血再灌注24h后升高明显,与其他各时间点比较差异有统计学意义(P＜0.05).(2)与脑缺血再灌注组相比,两Nec-1干预组神经功能损伤评分明显降低、梗死体积明显减小,差异均有统计学意义(P＜0.05);与Nec-1 (80 nmol)干预组相比,Nec-1(160nmol)干预组神经功能损伤及梗死体积的改善效果更为明显,差异均有统计学意义(P＜0.05).(3)HE染色显示脑缺血再灌注组梗死周围组织炎症细胞浸润、神经元减少、胞体皱缩、细胞核固缩;与脑缺血再灌注组相比,Nec-1干预组神经元增多、核固缩减轻、胞质染色较深.与脑缺血再灌注组相比,Nec-1干预组iba-1、TNF-α、IL-1β、GDNF免疫阳性细胞及蛋白表达均明显减少,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 程序性坏死途径参与大鼠脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞的活化;Nec-1干预可抑制小胶质细胞的活化,并通过对炎症因子的调控从而减轻神经元损伤.

Nec-1 对模拟缺氧条件下骨骼肌细胞损伤修复的作用研究

目的 探讨Necrostatin-1 (Nec-1 )在二氯化钴(CoCl2)诱导缺氧的条件下对骨骼肌细胞损伤修复的保护作用.方法 采用小鼠骨骼肌C2C12 成肌细胞为体外模型,CoCl2诱导缺氧,Nec-1为缺氧保护剂.将培养分化72 h 后的细胞分为4组,分别加入等量培养基(Control 组)、200 μM CoCl2(CoCl2组)、150 μMNec-1(Nec-1 组)、200 μMCoCl2+150 μMNec-1(CoCl2+Nec-1 组),于光镜下观察不同处理组细胞的肌管形态,采用蛋白免疫印迹技术检测肌细胞生成素(Myog)、肌细胞增强因子2A(MEF2A)蛋白表达的变化,统计细胞周期S期比例,划痕实验观察细胞的损伤修复能力.结果 CoCl2可诱导肌细胞形态异常,减少肌管分化,与Control组比较,CoCl2组Myog、MEF2A蛋白表达量降低(P均 ＜0. 01 ),同时,S 期细胞比例下降(P＜0. 01 ),划痕面积修复能力下降(P均 ＜0. 01).加入Nec-1 干预后,细胞形态恢复,肌管分化增多,与CoCl2组比较,CoCl2+Nec-1 组Myog、MEF2A蛋白表达量及S期细胞比例上调(P均＜0. 05 ),细胞划痕面积恢复(P＜0. 05 ).结论 CoCl2模拟缺氧可抑制肌细胞增殖、分化功能,导致肌细胞损伤修复能力下降.Nec-1 可增强缺氧条件下肌细胞的增殖和分化能力,对肌细胞的损伤修复有保护作用,可能通过抑制程序性坏死来促进肌细胞的损伤修复.

肾脏疾病中Necrostatin-1的作用研究进展

坏死性凋亡是一种非半胱天冬酶依赖的细胞程序性死亡方式,它通过死亡受体及精确的细胞通路来介导发生.在坏死性凋亡途径的激活中,受体相互作用蛋白激酶1和3(RIP1/3)扮演着重要的角色,上游的信号分子启动后,RIP1可以发生泛素化、去泛素化、磷酸化等一系列的反应,当蛋白激酶8被抑制时,RIP1与RIP3发生相互磷酸化,并形成了坏死性凋亡小体,从而介导了坏死性凋亡的发生.Necrostatin-1 (Nec-1)是RIP1的特异性阻断剂,可以阻断RIP1发生磷酸化,进而使细胞不发生坏死性凋亡.本文对坏死性凋亡的产生机制、Nec-1的结构和作用机制以及Nec-1在肾脏疾病方面应用的研究进展作一个综述,希望能够为肾脏疾病的诊断和治疗提供一些思路及靶点.

锰暴露诱导SK-N-SH细胞发生程序性坏死和凋亡两种死亡方式的比较研究

目的 比较研究程序性坏死和凋亡的两种方式在锰暴露诱导SK-N-SH细胞死亡中的作用.方法 体外培养人SK-N-SH细胞,将对数生长期细胞予以4001mol/L剂量的MnCL2.4 H20染毒,半小时后予以不同剂量的zVAD-fmk和Nec-1干预作用24小时,观察细胞形态变化,MTT法和流式细胞法分别检测两种药物干预后细胞存活度、细胞凋亡率及坏死率的变化.结果 与对照组比较,SK-N-SH细胞染锰24小时后,细胞胞体皱缩变圆、突起回缩变短、可见大量泡沫状改变,细胞存活率明显降低(P＜0.05),细胞凋亡及坏死率均明显升高(P＜0.05);与染锰组比较,zVAD-fmk 0.5 μmol/L及Nec-1干预组细胞的病理形态均有改善,Nec-1干预可提高染锰细胞的存活率并降低其坏死率(P＜0.05),高剂量Nec-1干预的效果明显.结论 在本试验条件下,细胞凋亡与程序性坏死的作用方式均参与了锰暴露诱导SK-N-SH神经的死亡;相比于细胞凋亡,抑制程序性细胞坏死的作用方式对拮抗锰对SK-N-SH细胞的毒性作用效果更佳.

紫草素诱导Raji细胞凋亡的机制研究

目的:研究紫草素(Shikonin)对Burkitt's淋巴瘤细胞凋亡及坏死的影响及Necrostatin-1 (Nec-1)对紫草素诱导的细胞凋亡的作用.方法:对体外培养的Raji细胞进行荧光显微镜观察,Alarma Blue法检测细胞增殖率,流式细胞仪分析细胞凋亡及坏死,免疫印迹检测相关蛋白表达.结果:紫草素对Raji细胞生长有抑制作用,呈时间和浓度依赖.紫草素可诱导Raji细胞发生程序性坏死及凋亡.小分子化合物Nec-1不仅可以抑制紫草素诱导的程序性坏死,同时对细胞凋亡也有抑制作用.结论:紫草素可以抑制Raji细胞生长增殖,而小分子Nec-1可以抑制这一过程.

Necrostatin-1对阿尔茨海默病细胞模型的保护作用

目的:研究程序性坏死在阿尔茨海默病(AD) 中的作用及Necrostatin-1(Nec-1) 对其保护机制.方法:采用25 μmol/L Aβ25-35作用于原代培养的小鼠皮层神经元36 h,复制AD细胞模型,分别加入不同浓度的Nec-1进行干预,采用MTT法评价细胞的存活率,试剂盒检测LDH的漏出量,用活细胞碘化丙啶(PI) 染色观察细胞坏死的情况,用Western Blot检测细胞的RIPK1、RIPK3和磷酸化MLKL蛋白的表达情况.结果:与对照组相比,模型组细胞存活率明显降低(P＜0.05) ,上清中LDH 含量明显升高,PI阳性细胞数量明显增多,有聚集成团现象,细胞RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白表达量水平均明显升高(P＜0.01) .Nec-1处理后对Aβ细胞毒性作用有明显的减轻,RIPK1、RIPK3和磷酸化MLKL蛋白表达量较模型组明显下降(P＜0.05,P＜0.01) .结论:Aβ25-35模拟的AD细胞模型中发生了程序性细胞坏死,Nec-1可能通过对抗程序性细胞坏死发挥神经保护作用.

Necrostatin-1对蛛网膜下腔出血后皮层细胞坏死状凋亡、坏死与自噬的影响

目的 研究necrostatin-1对蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后皮层细胞坏死状凋亡、自噬与坏死调节的作用.方法 72只SD大鼠随机分成假手术组、模型组、赋形剂组、necrostatin-1组.赋形剂组经侧脑室给予二甲基亚砜2μL,necrostatin-1组给予necrostatin-1 5.2μg溶于2μL二甲基亚砜.血管内穿刺法制作SAH模型.每组9只观察皮质受体相互作用蛋白3和微管相关蛋白1轻链3的变化,检测坏死状凋亡与自噬;9只腹腔注射碘化丙啶观察细胞坏死.对所有大鼠进行6、12、24h Loeffler神经行为学评分.结果 Necrostatin-1下调皮质受体相互作用蛋白3和微管相关蛋白1轻链3的表达(P<0.05),减少皮层碘化丙啶阳性细胞数目(P<0.05),提高12、24h的Loeffler神经功能评分(P<0.05),有改善SAH预后的作用.结论 Necrostatin-1可能在抑制SAH后脑细胞坏死状凋亡时也下调了自噬与坏死水平.

RIP1/RIP3通路介导氯化血红素诱导的HT-22海马神经细胞损伤的研究

目的 探索受体相互作用蛋白激酶1(RIP1)/RIP3通路是否参与氯化血红素(hemin)诱导的HT-22海马神经细胞损伤以及研究Necrostatin-1(Nec-1)在hemin诱导的HT-22细胞死亡中潜在的神经保护作用.方法 给予不同浓度的hemin(0、25、50、100μmol/L)作用HT-22细胞24 h后测定碘化丙啶(PI)阳性细胞数和细胞存活率.用Necrostatin-1、zVAD和活性氧(ROS)清除剂叔丁基茴香醚(BHA)分别处理hemin诱导的HT-22细胞,24 h后分别测定各组PI+细胞数、细胞存活率,使用MitoSox Red指示ROS水平.后研究使用siRNA敲低RIP3水平对hemin诱导HT-22细胞死亡的影响,测定各组PI+细胞数、细胞存活率及ROS水平.结果 Hemin可剂量依赖性的诱导HT-22神经细胞死亡;RIP1抑制剂Necrostatin-1可显著抑制hemin诱导的HT-22细胞死亡,PI+细胞数明显减少,细胞存活率提高,并且减少ROS积聚;BHA可显著减少hemin诱导的HT-22细胞的PI+细胞数.更进一步的使用siRNA敲低RIP3表达水平可以显著减少hemin诱导的HT-22细胞死亡,PI+细胞数明显减少,细胞存活率明显提高,ROS积聚水平显著减低.结论 RIP1/RIP3通路及ROS可能介导hemin诱导的HT-22海马神经元细胞死亡,Necrostatin-1在其中起神经保护作用.