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缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞Necroptosis模型的建立
目的:采用拟缺血再灌注损伤结合z-VAD-FMK(Benzyloxyearbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone,z-VAD-FMK)干预,探索一种脑微血管内皮细胞(Brain Microvascular Endothelial Cells,BMECs)Necroptosis模型.方法:首先利用原代大鼠脑微血管内皮细胞,采用氧糖剥夺及复氧复糖方法,筛选出拟缺血再灌注损伤时间点.在拟缺血再灌注模型基础上,予Casepase抑制剂z-VAD-FMK 20 μmol/L干预,采用CCK-8检测细胞活性;透射电镜观察细胞超微结构;Annexin V-FITC/PI(Propidium Iodide)双染色法检测细胞死亡方式.结果:确定氧糖剥夺2 h复氧复糖8 h,作为拟缺血再灌注时间点;z-VAD-FMK作用于拟缺血再灌注损伤BMECs后,细胞活性无统计学意义;z-VAD-FMK干预组在电镜下呈现明显的Necroptosis特征;流式检测显示,各象限细胞比率无明显变化,但Necroptosis特异性抑制剂Nec-1可显著降低Q2象限细胞比率,提示z-VAD-FMK干预抑制了细胞晚期凋亡,诱导了Necroptosis的发生.结论:z-VAD-FMK可诱导拟缺血再灌注脑微血管内皮细胞发生Necroptosis,为以后研究缺血性脑中风necroptosis机制提供了细胞实验模型.
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非洲爪蟾卵无细胞凋亡体系的建立
目的建立一种简便、高效的无细胞凋亡体系,探讨外源细胞核在其中的凋亡过程及z-VAD-fmk对其的抑制作用.方法超速离心制备非洲爪蟾卵无细胞体系,用细胞色素C激活为凋亡体系.应用荧光显微镜、琼脂糖凝胶电泳、ApoAlert Caspase-3 Colorimetric Assay等方法检测外源细胞核在无细胞凋亡体系中的凋亡过程及z-VAD-fmk的抑制作用.结果制备的爪蟾卵无细胞体系可由细胞色素C激活为凋亡体系,外源加入的细胞核呈现典型的形态学变化,总DNA特异降解形成DNA ladder.体系内内源特异核酸酶被激活.z-VAD-fmk可抑制DNA ladder的形成.凋亡特异蛋白酶XCPP32活性明显升高.结论本实验建立的无细胞凋亡体系可以高效的诱导外源细胞核凋亡,重现体内过程.
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广谱caspase抑制剂对大鼠烫伤后肾脏的保护作用
目的：观察广谱caspase抑制剂(z-VAD-fmk)对大鼠烫伤后肾脏组织的保护作用。方法72只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、致伤组和给药组，每组24只，各组设2、8、24、48h共4个相应时段，每时段6只，给药组致伤后即刻经尾静脉注射 z-VAD-fmk 3mg/kg，以后1.5mg/kg每12h经腹腔注射1次，致伤组用同样方法注射与给药组等体积的生理水，对照组不做处理，致伤组和给药组烫伤后用Parkland公式补液，并根据给药量相应减少补液量，分别于上述各时段处死大鼠并留取肾脏组织，行HE染色观察肾组织的病理改变，TUNEL法检测肾脏细胞的凋亡，荧光比色法检测Caspase-3活性。结果与致伤组相比，给药组病理切片显示肾脏组织损伤有所减轻；肾脏细胞凋亡指数（AI）在烫伤8、24及48h后明显降低（P<0.01）；caspase-3活性在伤后2、8、24及48h均明显降低（P<0.01）。结论早期应用z-VAD-fmk治疗可以有效地减少肾脏细胞的凋亡，进而减轻肾脏的损伤，起到保护肾脏的作用。
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caspase抑制剂z-VAD-fmk对阿霉素损伤乳鼠心肌细胞calumenin、caspase-3、GRP78及GRP94表达的影响
目的:研究细胞凋亡限速酶caspase广谱抑制剂z-VAD-fmk对阿霉素损伤心肌细胞calumenin、caspase-3、GRP78及GRP94表达的影响,探讨心肌细胞网腔钙结合蛋白与内质网应激及心肌细胞凋亡是否存在相互调控关系.方法:原代培养乳鼠心肌细胞实验分为3组:对照组(正常细胞)、阿霉素组(3 mg/L阿霉素+心肌细胞)、Z-VAD-fmk组(3 mg/L阿霉素+0.1 μmol/L Z-VAD-fmk+心肌细胞),每组细胞设3个复孔,分别处理后置37℃、CO2培养箱中培养24h阿霉素组、z-VAD-fmk组.采用免疫组化方法检测培养乳鼠心室肌细胞α-SMA蛋白.采用Westernblot技术检测各组心肌细胞Calumenin、内质网应激伴侣蛋白GRP78、GRP94及caspase-3表达.结果:与对照组相比较,阿霉素组心肌细胞cahumenin表达明显减少(P＜0.01),GRP78、GRP94及caspase-3表达增加(P＜0.01).与阿霉素组相比较,z-VAD-fmk组心肌细胞calumenin表达增加(P＜0.01),而GRP7,GRP94及caspase-3减少(P＜0.01).结论:caspsse广谱抑制剂z-VAD-fmk增加阿霉素损伤心肌细胞calumenin表达进而缓解内质网应激.
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z-VAD-fmk对吸入性损伤小鼠肺脏细胞凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响
目的:观察广谱caspase抑制剂(z-VAD-fmk)对吸入性损伤小鼠肺脏细胞凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响.方法:72只BALB/c小鼠造模后随机分为对照组与治疗组各36只,每组设2、6、12、24、48、72h共6个相应时段,每时段6只,治疗组腹腔给予z-VAD-fmk 6mg/kg,对照组用生理盐水代替,分别于上述各时段剖胸取肺,行常规病理切片并用免疫组化方法观察Bcl-2和Bax表达的变化,计算各时相点肺脏细胞凋亡指数(AI).结果:小鼠吸入性损伤6 h后,与对照组相比,治疗组AI降低,Bax表达减弱,Bcl-2表达增强,差异具有统计学意义(P＜0.05),12 h后差异具有显著性(P＜0.01).结论:小鼠吸入性损伤后,z-VAD-fmk可以增强Bcl-2表达及减弱Bax表达,抑制肺脏细胞凋亡.
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z-VAD-FMK对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用
目的:探讨z-VAD-FMK对大鼠肾缺血再灌注损伤的影响及其机制.方法:30只雄性SD大鼠随机分为3组:假手术组、对照组(DMSO组)、给药组(z-VAD-FMK组),每组10只.对照组和给药组大鼠采用切除右肾,夹闭左侧肾动脉45 min后再恢复血流的方法制成肾缺血再灌注模型,于模型完成前15 min尾静脉给药;假手术组只切除右肾.模型成功后24 h收集大鼠血清和肾脏组织;测定血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN);HE染色观察肾组织病理改变;TUNEL检测肾细胞凋亡;ELISA检测TNF-α、IL-10浓度;Western blot检测caspase-3和caspase-8表达.结果:与对照组相比,给药组Scr与BUN水平明显降低(P＜0.01);HE染色可见肾小管上皮细胞脱落、间质水肿、炎细胞浸润明显减少;肾小球和肾小管上皮细胞凋亡指数明显降低(P＜0.01);TNF-α、IL-10表达水平明显降低(P＜0.01);caspase-3和caspase-8表达明显降低(P＜0.01).结论:z-VAD-FMK对大鼠肾缺血再灌注损伤有保护作用,其机制可能与抑制细胞凋亡,减轻炎症损伤有关.
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z-VAD-FMK与Necrostatin-1联合对MODS大鼠器官的保护作用研究
目的:探讨z-VAD-FMK与Necrostatin-1联合对MODS大鼠器官的保护作用.方法:采用失血性休克-内毒素“二次打击”建立大鼠MODS动物模型.将80只雄性SD大鼠随机分为4组:z-VAD-FMK组、Nec-1组、z-VAD-FMK+Nec-1组、模型组,每组20只,观察72 h死亡率.另取40只雄性SD大鼠随机分为5组:假手术组、z-VAD-FMK组、Nec-1组、z-VAD-FMK+Nec-1组、模型组,每组8只,分别于注射内毒素和生理盐水后24 h收集血清和肝、肺、肠组织.全自动生化仪检测血清ALT、AST的变化,血气分析仪检测PaO2的变化,ELISA检测血清TNF-α、IL-1β的变化,HE染色观察肝、肺、肠组织的病理学改变.结果:大鼠遭受失血性休克-内毒素“二次打击”后,血清ALT、AST明显升高(P＜0.01),PaO2显著下降(P＜ 0.01),血清炎性因子TNF-α、IL-1β水平明显升高(P＜0.01).光镜下见肝窦明显扩张、淤血,肝小叶结构紊乱,肝细胞部分变性、坏死;肺泡壁结构被破坏,肺间质充血,大量炎性细胞浸润;肠绒毛结构被破坏,部分绒毛顶部细胞、隐窝细胞变性、坏死,大量炎性细胞浸润.而z-VAD-FMK组、Nec-1组及z-VAD-FMK+Nec-1组ALT、AST升高程度、PaO2下降程度、TNF-α、IL-1β升高程度均显著低于模型组(P＜0.01),以z-VAD-FMK+Nec-1组变化明显.72 h死亡率均较模型组显著降低(P＜0.05).结论:z-VAD-FMK、Nec-1、z-VAD-FMK+Nec-1联合治疗均可显著减轻MODS大鼠的器官损伤,联合治疗效果更佳.
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Caspases抑制条件下5-FU诱导乳腺癌细胞发生坏死性凋亡的作用
目的 探讨5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的抑制作用,并在抑制caspases的条件下,对5-FU诱导的乳腺癌细胞的死亡形式进行探讨. 方法 MTT法检测不同浓度的5-FU(0,4,8,16,24,32 μmol/L)对乳腺癌细胞增殖的抑制作用,筛选适宜的药物浓度.在适宜药物浓度下实验分为对照组、z-VAD-fmk组、5-FU组、5-FU+z-VAD-fmk组,MTT法检测乳腺癌细胞存活率;PI单染流式细胞术检测乳腺癌细胞的死亡率;DAPI染色检测乳腺癌细胞核的变化;透射电镜观察乳腺癌细胞的死亡形式;Western blot检测坏死性凋亡蛋白RIP1表达的变化. 结果 8μmol/L为5-FU的适宜浓度,该浓度下MDA-MB-231细胞在24 h,48 h,72 h的存活率分别为(68.94 ±1.17)％,(48.76±1.47)％和(44.15±2.41)％.MTT、PI、DAPI实验结果表明与对照组和5-FU组相比,5-FU+ z-VAD-fmk组细胞存活率明显降低(P＜0.05),细胞核浓染加深,核固缩现象显著.电镜结果显示5-FU组细胞发生凋亡,5-FU+ z-VAD-fmk组细胞发生坏死性凋亡.Western blot结果表明:z-VAD-fmk联用时5-FU明显上调RIP1蛋白的表达. 结论 5-FU可以诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡;caspases抑制条件下5-FU通过激活RIP1诱导MDA-MB-231细胞发生坏死性凋亡.
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Caspase抑制剂对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响
目的 探讨Caspase抑制剂z-VAD-fmk对缺血-再灌注(I-R)心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响.方法 24只大鼠随机分为假手术(C)组、I-R对照(B)组和z-VAD-fmk治疗(A)组,以穿线结扎或松扎左冠状动脉制备大鼠心肌I-R模型,TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数(AI),免疫组化法检测Bcl-2、Pax蛋白表达,并分析心肌组织病理学损害程度.结果 B组和A组Bcl-2、Bax基因蛋白表达水平均明显高于C组(P<0.05).A组凋亡指数显著低于B组;与B组比较,A组Bax蛋白表达水平有所下降,而Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05),Bcl-2/Bax比值较对照组明显增加.结论 Caspase抑制剂可抑制I-R后心肌细胞凋亡,其机制可能与上调Bcl-2和下调Bax蛋白表达有关.
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LPS联合z-VAD-FMK介导IFN-γ预处理巨噬细胞发生程序性坏死
目的:探讨脂多糖(LPS)联合z-VAD-FMK介导M1亚型巨噬细胞程序性坏死的机制.方法:使用佛波酯(PMA)和干扰素γ(IFN-γ)诱导THP-1细胞系分化得到M0和M1亚型巨噬细胞.以LPS(100μg/L)分别处理M0和M1巨噬细胞,检测不同时点的乳酸脱氢酶释放和DNA断裂情况,并观察不同抑制剂的影响.采用Western blot法检测受体相互作用蛋白(RIP)1、RIP3、细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、P38和NOD样受体蛋白3(NLRP3)的蛋白水平.结果:LPS能够诱导M1亚型巨噬细胞发生死亡,联合z-VAD-FMK可特异性介导M1亚型巨噬细胞发生程序性坏死,而对M0亚型巨噬细胞无此作用.IFN-γ能够上调RIP3表达,并增强LPS介导的JNK磷酸化,RIP3和JNK抑制剂可部分阻断LPS联合z-VAD-FMK介导的M1亚型巨噬细胞程序性坏死.结论:IFN-γ上调RIP3和增强LPS介导的JNK磷酸化,使得LPS联合z-VAD-FMK能特异性诱导经过IFN-γ预处理的巨噬细胞发生程序性坏死.
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Carfilzomib联合Z-VAD-FMK对肿瘤恶病质的防治作用
目的 评价联合运用蛋白酶体抑制剂Carfilzomib与Caspase抑制剂Z-VAD-FMK对肿瘤恶病质的防治作用及其机制.方法 BALB/c小鼠前腋皮下接种结肠腺癌C26细胞,建立肿瘤恶病质动物模型.随后在不同时间点给予Carfilzomib和Z-VAD-FMK单独与联合用药,检测荷瘤小鼠体质量、腓肠肌质量、肿瘤质量和体积、自发性生理活动和生存时间;qRT-PCR和Western blot检测腓肠肌Caspase3、MuRF1和MAFbx的mRNA表达水平和蛋白水平.结果 Carfilzomib与Z-VAD-FMK联合作用缓解荷瘤小鼠体质量下降,抑制骨骼肌萎缩和肿瘤生长,提高自发性生理活动和延长生存时间;减少腓肠肌MuRF1、MAFbx和Caspase3表达;联合作用大于单独用药(P＜0.05),预防作用明显大于治疗作用(P＜0.05).结论 Carfilzomib与Z-VAD-FMK联合作用抑制了恶病质荷瘤小鼠腓肠肌泛素蛋白酶体通路和凋亡通路,可以预防和治疗肿瘤恶病质的发生、发展.
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PARP-1/AIF通路在大鼠实验性蛛网膜下腔出血后早期细胞凋亡中的作用和意义
目的 探讨在大鼠实验性蛛网膜下腔出血(SAH)模型应用Caspase抑制剂后,海马区细胞多聚(腺苷二磷酸2核糖)聚合酶[poly (ADP-ribose) -polymerase 1,PARP-1 ]/凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)凋亡途径的变化.方法 将64只SD大鼠分为空白对照组、模拟手术组、非抑制组[SAH+DMSO(24、48、72h)]和抑制组[SAH+Z-VAD-FMK (24、48、72h)],采用单次视交叉池注血模型建立大鼠SAH.抑制组用广谱caspases抑制剂Z-VAD-FMK行大鼠右侧脑室缓慢注射.各时间点标本用多聚甲醛灌注处理;免疫组化测定海马组织Caspase3、PARP-1和AIF表达;TUNEL检测海马组织细胞凋亡程度.比较各组Caspase3、PARP-1和AIF蛋白表达及细胞凋亡.结果 抑制组大鼠PARP及AIF均较其它各组表达强(P＜0.05);抑制组大鼠海马组织细胞凋亡较非抑制组减轻(P＜0.05),高于空白组和模拟手术组(P＜0.05),提示细胞凋亡未得到满意抑制.结论 在Caspase凋亡途径被抑制情况下,SAH后早期脑细胞凋亡可能主要由PARP-1/AIF通路可能介导.
