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成人骨髓基质干细胞体外成骨细胞分化诱导
建立成人骨髓基质干细胞分离、扩增,以及诱导和分化为成骨细胞的体外培养方法,为骨组织工程选择理想的种子细胞来源.抽取健康成人骨髓组织,用Percoll分离液分离出骨髓中的单个核细胞,在含体积分数为10%小牛血清的高糖DMEM培养液中,置于37℃、含体积分数为5%的CO2湿化空气孵箱中培养,通过传代培养扩增骨髓基质干细胞,传三代时改用含地塞米松、β-甘油磷酸和维生素C的条件培养基培养,用倒置显微镜、HE染色观察增殖和分化情况,并测定碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力.采用本法在体外培养的成骨细胞生长良好,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性.本研究所建立的成人骨髓基质干细胞分离、扩增,以及诱导和分化为成骨细胞的体外培养方法稳定和实用,可作为骨组织工程种子细胞来源的常规方法之一.
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干细胞制品临床前药效学及安全评价研究概况
Back 等[1]1968年报道骨髓移植治疗湿疹血小板减少伴免疫缺陷症以来，细胞制品作为一种很有价值的资源一直用于治疗多种疾病。由于干细胞具备自身更新和分化的能力，其衍变而来的临床用生物制品可能具有与其本身不同的生物学特征，故干细胞制品是一种不同于基础细胞的生物制品。目前，对此类干细胞制品的生物学特性及临床应用价值仍处于研究探索阶段，但对不同类别的干细胞制品的研究探索程度不同，例如，间充质干细胞（mesenchymal stem/stromal cells，MSCs）/基质干细胞、造血干细胞等已有大量临床前研究和临床使用的报道[2-4]，而人胚胎干细胞（ human embryonic stem cells ， hESCs ）或诱导性多功能干细胞（induced pluripent stem cells，iPSCs）目前还缺乏足够的临床前资料，尚未进入临床使用。虽然许多临床观察结果令人鼓舞，而且新的治疗领域不断扩展，但干细胞的临床应用仍存在一定的安全风险。本文结合近年来干细胞的临床前研究，对干细胞制品的治疗效果和安全风险等进行综述。
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自体骨髓基质干细胞移植对扩张型心肌病心功能及血浆脑钠肽的影响
目的探索自体骨髓基质干细胞(MSCs)移植对兔扩张型心肌病(DCM)心功能及血浆脑钠肽(BNP)的影响.方法 36只健康大白兔经耳缘静脉注射盐酸阿霉素建立DCM模型后,将存活兔随机分为细胞移植组、对照组和假手术组.移植前和移植后4周,采用超声心动图测定左室收缩末期内径(LVDs)、左室舒张末期内径(LVDd)及左室射血分数(LVEF),并测定血浆BNP水平.移植后4周测定血流动力学指标,免疫荧光检测移植区组织内存活的移植细胞.结果移植后4周移植组的左心室收缩压、压力变化大速率及LVEF明显高于其他两组(P＜0.01).移植组的LVDd、LVDs和左室舒张末压较假手术组明显减小(P＜0.05、P＜0.01).移植后4周移植组的血浆BNP水平显著下降(P＜0.01),而对照组及假手术组中均无显著性改变;移植组组织切片可见BrdU染色阳性细胞,核发绿色荧光,其他组均未见BrdU染色阳性细胞.结论 MSCs移植能改善阿霉素诱导DCM的心功能,作用机制中神经体液调节可能起重要作用.
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骨髓脂肪细胞生成及其在骨质减少性疾病中的意义
骨髓基质系统由基质细胞谱系构成,包括未分化的基质干细胞及定型分化的脂肪细胞、成骨细胞、造血支持细胞等多种细胞类型.在定型分化的细胞中,以脂肪细胞为丰富.骨髓脂肪细胞生成在机体的能量储存、骨代谢、脂肪代谢、造血支持中发挥重要的病理生理学作用.尤其因增龄、绝经、代谢性异常等导致的多种骨质减少性疾病中,骨体积的减少则伴随骨髓脂肪成分的增加,脂肪细胞生成是骨质减少性疾病中的重要并发症.笔者旨就骨髓脂肪细胞功能、分化机制及其在骨质减少性疾病发生机理及临床治疗中的意义作一综述.
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犬骨髓基质干细胞向软骨样细胞诱导分化的条件研究
目的 研究犬骨髓基质干细胞在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的佳条件.方法 从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型.结果 原代培养的基质干细胞集落融合周期约6～9 d左右.第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子(TGF.131)诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性.结论 犬骨髓基质干细胞在体外培养在碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子(TGF-β1)作用下可被诱导分化为软骨样细胞.
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骨髓移植在骨折愈合中的应用进展
骨髓移植是促进骨折愈合的重要手段,骨髓的成骨特性不断在实验及临床应用中得到证实,骨髓的成骨特性主要基于骨髓基质干细胞、骨形态发生蛋白及骨祖细胞的存在,而目前对骨髓成骨特性的研究主要分体内实验和体外实验,并且体外细胞培养及特性研究是重中之重.
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脐带血间质干细胞生物学特性研究
本文旨在探讨从人脐带静脉血是否可分离出基质干细胞,如果可以,确定它们的特性,方法是采用不支持造血干细胞生长的培养基培养脐血单个核细胞,对其生物学特性进行研究.1 资料与方法1.1 12份脐血采至厦门市中山医院,每份30～60 ml.1.2 基质细胞的分离与培养经新生儿父母同意,于厦门市中山医院采集正常足月新生儿脐带血12份,用L-DMEM培养液悬浮制备好的细胞,接种于25 cm2培养瓶中培养.细胞达到70%汇合时进行传代.
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人胎儿骨髓基质干细胞的分离、体外培养和鉴定
目的分离培养并鉴定人胚胎骨髓基质干细胞.方法抽取流产胎儿股骨骨髓,Percoll离心纯化分离,取界面有核细胞培养.不同培养基培养对比,观察细胞生长曲线,免疫细胞化学鉴定细胞膜表面分子.结果得到纯化率较高的骨髓基质干细胞(MSCs),用αMED比DMEM和RPMI1640原代培养生长速度快,第二代MSCs在上述三种培养基中倍增时间分别为43h、54h、56h.免疫细胞化学结果99%CD44(+)、98%Vim(+)、所有细胞CD34(-)、CD29(-).结论Percoll离心法成功地分离纯度较高的MSCs.MSCs在αMEM中培养增殖率比在DMEM和M1640中培养为快.
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Wnt/β-catenin对BMPs信号通路的调节在基质干细胞向成骨细胞分化过程中的作用
骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)是一种能够自我更新,具有多向分化潜能的细胞.BMSCs在不同的诱导因素作用下,能够向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和造血细胞等方向分化[1].研究证实[2]WNT/β-catenin信号途径、BMPs信号途径可调节BMSC增殖、成骨分化、成熟及成骨细胞正常功能.有报道Wnt/β-catenin能够诱导BMPs信号通路在细胞中的表达.表明这两条信号途径在BMSc成骨分化过程可能存在中相互协调[3].
关键词： Wnt/β-catenin BMP 基质干细胞 成骨细胞 -
Wnt信号激活剂氯化锂抑制脂肪细胞分化的研究
目的：证实Wnt信号激活剂（氯化锂）可以抑制骨髓基质干细胞（ BMSCs）向脂肪细胞分化的作用。方法体外培养 Balb/c小鼠骨髓基质细胞并诱导其向脂肪细胞分化，再用Wnt信号激活剂氯化锂干预，用油红O染色观察脂肪细胞的形成，RT-PCR检测骨髓基质细胞中脂肪细胞 PPAR-γ和成骨细胞Runx-2相关基因的表达。结论 Wnt信号激活剂氯化锂可以抑制骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化。
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微载体悬浮培养体系对人脂肪基质干细胞增殖与分化的影响
目的:观察微载体悬浮培养系统对成人脂肪基质干细胞的培养效果及培养后细胞的分化能力.方法:实验于2004-09/12在军事医学科学院组织工程中心完成.悬浮培养系统采用Cytodex3微载体为贴壁依赖性细胞脂肪基质干细胞提供贴壁条件,浓度为5 g/L.常规静止培养在12孔培养板中进行.两系统细胞接种密度均为1×108 L-1.分别观察细胞增殖情况,并对用悬浮培养体系培养的细胞进行细胞表型及分化能力检测.结果:微载体悬浮培养9 d后达到大活细胞密度(1.60×109 L-1),常规静止培养第7天就达到大活细胞密度(3.38×108 L1).在微载体悬浮培养条件下,脂肪基质干细胞生长更为旺盛,细胞产量更高,优于常规静止培养.微载体悬浮培养11d后,脂肪基质干细胞依然保持多向分化能力.结论:利用悬浮培养体系系统以及微载体技术有利于脂肪基质干细胞的大规模快速生长,细胞扩增后仍然保持其细胞表型及分化能力.获得的脂肪基质干细胞可以作为组织工程种子细胞实验研究及其临床应用.
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大鼠骨髓基质干细胞的分离培养及其向成骨细胞分化的研究
目的 研究大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)分离培养的方法,并采用药物对其进行成骨诱导,探讨大鼠BMSCs在体外向成骨细胞分化的能力.方法 本实验于2010年在中国医科大学口腔医学院中心实验室进行,采用全骨髓培养法进行大鼠BMSCs的分离与培养,光镜下观察细胞形态,之后细胞传代到所需数量后,随机分为2组,诱导组采用药物法(0.1μmol/L的地塞米松、10 mmol/L的β-磷酸甘油钠、0.2mmol/L维生素C)进行成骨诱导,非诱导组未采用任何方法进行成骨诱导.在诱导的第1、3、5天,分别对两组细胞取样,进行细胞活性检测和碱性磷酸酶检测；在诱导的第5天进行扫描电镜观察.比较两组细胞成骨能力.结果 光镜下,分离培养的细胞呈圆形、多角形、梭形等成纤维细胞样外观,细胞核浆比例较大,透光度较高,连续培养后呈现束状和漩涡状生长,符合基质干细胞的形态学特征.在成骨诱导的第1天,两组细胞的活性检测差异有统计学意义(P＜0.05),碱性磷酸酶表达差异无统计学意义(P＞0.05)；在诱导的第3、5天,两组细胞的活性检测、碱性磷酸酶表达差异均有统计学意义(P＜0.05).在诱导培养的第5天,扫描电镜下观察可见两组细胞形态不同.结论 采用全骨髓培养法可对大鼠BMSCs进行有效的分离培养,分离出的细胞符合基质干细胞特点；通过地塞米松、β-磷酸甘油钠、维生素C可对其进行有效的成骨诱导.
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低剂量辐射诱导人骨髓基质干细胞适应性反应的信号传导机制
目的 探讨低剂量辐射(LDR)是否可以诱导人骨髓基质干细胞(MSC)发生适应性反应以及相关的信号传导的机制.方法 选择健康成年人MSC进行培养,待其生长至对数生长期后,将其分成分别假照组、单纯D2和D1对照组及实验组,实验组根据照射剂量和时间间隔不同又继续分成25、75、200 mGy照射4、24、48 h后接受高剂量2.0 Gy照射共9组.高剂量照射后4 h进行细胞计数、MTT及流式细胞仪检测细胞凋亡,确定细胞发生适应性反应的佳剂量和时间间隔后,应用75 mGy照射24 h后接受2.0 Gy照射并免疫印迹法检测p-P38MAPK、总P38MAPK、P53、P21蛋白的表达.结果 LDR确实可以诱导MSC发生适应性反应,表现在预先进行LDR后可以使大剂量照射后发生细胞凋亡的百分率下降,且其佳剂量和时间间隔为D1是75mGy,照射24 h后接受2.0 Gy照射发生适应性反应明显,与单纯D2对照组相比,实验组P53、P21蛋白表达明显下降,p-P38MAPK表达增加(P＜0.05),而总P38MAPK表达无明显变化(P＞0.05).结论 LDR可以诱导MSC发生适应性反应,佳剂量和时间间隔为D1是75 mGy,照射24 h后接受2.0 Gy照射发生适应性反应明显,其发生适应性反应是通过P38MAPK途径介导的,并与P53和P21的表达降低有关.
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透明质酸复合BMP-2转染骨髓基质干细胞修复兔桡骨干缺损的生物力学研究
目的 评价携带人骨形成蛋白-2(hBMP-2)基因重组腺病毒(Adv-hBMP-2)转染的骨髓基质干细胞(BMSCs)与透明质酸(HA)复合构建的组织T程化骨对兔桡骨干缺损的修复效果.方法 取兔骨髓行BMscs培养及Adv-hBMP-2的体外转染,建立兔桡骨干1.5cm的缺损模型.20只兔(40侧)分4组(n=10):第1组注射Adv-hBMP-2转染细胞+HA组,第2组注射Adv-hBMP-2转染细胞组,第3组单纯注射HA组、第4组空白对照组;通过影像学、组织学检查、生物力学测试和骨组织形态计量分析观察修复效果.结果 (1)第1组,第12周8侧骨缺损中6侧完全愈合:第二组第12周8侧骨缺损中有3侧完全愈合:第3组和第4组,第12周骨缺损均未愈合.根据骨缺损内新生骨面积行X线疗效评分,各组依次为4.63±0.74、3.38±1.60、1.63±0.74、1.50±0.53,差异有统计学意义(P<0.0001).(2)第1、2组,4～8周时骨缺损内均有多量新生骨痂形成,12周时部分骨髓腔再通;第3、4组,4～8周时骨缺损处为纤维组织填充,12周时骨缺损未愈合,两骨端硬化.新生骨小梁面积第1、2组分别为(16.25±3.49)mm2、(10_37±2.02)ram2,差异有统计学意义(P<0.001).(3)第1组的大压缩载荷和弹性模量分别为(211.54±63.58)N和(113-36±56.47)Mpa,第2组分别为(126.74±53.13)N和(98.91±63.36)Mpa,差异有统计学意义(P<0.05).平均大压缩载荷与正常桡骨组之比:前者为75.86%,后者为45.45%.结论 HA复合Adv-hBMP-2转染BMSCs构建的组织工程化骨可以修复兔桡骨干骨缺损.
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Micro RNAs通过BMP／TGF-β信号通路调节骨形成的研究进展
1 microRNAs在骨形成中的作用
microRNAs（miRNAs）是一类内源性单链小分子（～22nt ）非编码 RN A 序列，通过抑制靶基因转录及下调蛋白表达在多种生理和病理过程中起到重要的调控作用［1］。越来越多的研究表明， miRN A s在干细胞工程中具有潜在的应用价值，同时参与并调节骨形成和骨重建［2］，如：miR‐96促进MC3T3‐E1细胞成骨分化，而miR‐125 b可以通过下调Cbfβ表达抑制C3H10T1／2细胞增殖和成骨分化［3‐4］，miR‐21过表达的骨髓间充质干细胞可以加速大鼠闭合性股骨骨折愈合［5］，转染miR‐26a的脂肪来源干细胞结合羟基磷灰石（HA ）支架能够显著促进大鼠胫骨骨缺损中的新骨形成，因此结合miR‐26a的骨替代体在骨缺损修复中具有可观的治疗潜能［6］。基质干细胞具有自我更新和多分化潜能，在不同条件下可以分化多种细胞，包括成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞［5］。miRNAs具有调节并决策基质干细胞分化方向的能力。过表达miRN A‐22能够抑制靶基因 HDAC6，进而促进人脂肪来源基质干细胞成骨分化而抑制其成脂分化［7］。miR‐146a过表达促进胎儿股骨干细胞成骨分化而抑制其成软骨分化［8］。以上研究均表明，miRNAs具有严格的调控机制，在成骨分化及骨形成方面发挥重要的调节作用。 -
肝衰竭和肝硬化的干细胞治疗
不同原因的慢性肝损害均可导致肝衰竭、肝硬化；表现为序贯或重叠的严重病理过程，包括剧烈的炎症反应、肝细胞坏死、肝纤维化／硬化，死亡率高［1］。对肝移植的迫切需求与供体肝短缺之间矛盾突出，彰显发展新治疗策略的必要性。近的研究显示：基于干细胞的治疗手段能减缓肝脏炎症，改善瘢痕化和更新肝细胞，有望成为治疗肝衰竭、肝硬化的策略［2］。截止至2012年11月1日，在 ClinicalTrials．gov 网站检索“stem cells AND liver diseases”，有超过170项已注册或等待批准的临床研究。间充质干细胞（MSCs）是基质干细胞异质亚群，主要表达 CD105、CD73、CD44、CD90和 CD71；较少表达造血细胞标记如 CD45、CD34和 CD14，或协同刺激分子 CD80和 CD86。MSCs 可从不同组织如骨髓、脂肪组织、胎盘以及脐带胶质获取。重要的是，MSCs 不仅可分化成间充质细胞系和其它胚胎细胞系，在体内还具有介导免疫调节的功能［3］。小样本的临床研究报道，输注 MSCs 的耐受性和安全性良好并使肝衰竭患者获益：改善肝脏功能、降低 Child-Pugh 和 MELD 评分、减少腹水及总死亡率（见表1）［4-8］。然而，临床干细胞治疗的长期安全性和有效性方面仍有一些关键问题悬而未决。
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脂肪来源干细胞研究现状及其在组织工程中的应用
随着组织工程研究的迅速发展,在组织器官的修复和替代上,已经取得了很大的进展.对种子细胞的选择,也越来越倾向于体外扩增能力强、供区损失小的基质干细胞.近年来,随着对成体干细胞(Adult Stem Cells)认识的深入.
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成人骨髓基质干细胞体外诱导成骨细胞
目的建立成人骨髓基质干细胞(BMSCs)分离、扩增以及诱导和分化为成骨细胞的体外培养方法,为骨组织工程选择理想的种子细胞来源.方法抽取健康成人骨髓组织,用Percoll分离液分离出骨髓中的单个核细胞,在含体积分数为10%小牛血清的高糖DMEM培养液中,置于37℃、含体积分数为5%的CO2湿化空气孵箱中培养,通过传代培养扩增BMSCs,传三代时改用含地塞米松、β-甘油磷酸和维生素C的条件培养基培养,用倒置显微镜、HE染色观察增殖和分化情况,并测定碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力.结果体外培养的成骨细胞生长良好,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性.结论所建立的成人BMSCs分离、扩增以及诱导和分化为成骨细胞的体外培养方法稳定和实用,可作为骨组织工程种子细胞来源的常规方法之一.
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间充质干细胞在造血干细胞移植中的作用
造血干细胞(hemapoietic stem cell,HSC)是早被认识也是至今研究得清楚的干细胞.很长一段时间,人们认为骨髓中只存在一种干细胞即造血干细胞,1867年Cohnheim提出了骨髓中可能存在另一类干细胞即非造血干细胞的观点,但直到1960年,Friedenstein[1]才证实了骨髓中非造血干细胞的存在,并称之为多能基质干细胞.此后,陆续有一系列的研究证实骨髓中确有非造血干细胞的存在,因为它们的形态呈成纤维样细胞外观,称它们为集落形成单位成纤维细胞、骨髓基质成纤维细胞等,目前这些名称已较少使用..1985年Owen[2]提出了基质系统的概念,并对其进行了描述,认为骨髓基质是造血微环境的重要组成部分,对骨髓造血具有重要意义.1994年Caplan[3]又将之命名为骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC).目前,间充质干细胞已成为相关组织工程、细胞移植和基因治疗等领域研究的重点之一.
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梯度降解软骨支架材料应力刺激下与骨髓基质干细胞复合三维培养的实验研究
[目的]探讨梯度降解软骨支架材料(GDABM)的细胞生物相容性及诱导后的骨髓基质干细胞(MSCs)在三维支架上培养的生物学行为.[方法]将MSCs与复合转化生长因子-β(TGF-β)的胶原共同混合后培养于三维软骨支架材料上,离心管内培养,10次/d,以600 r/min离心10 min.8 h、24 h、72 h、4 d、7 d进行倒置显微镜形态学观察、扫描电镜观察.1～8 d采用MTT法检测细胞增殖活性,描绘生长曲线.通过3H-Proline掺入实验了解材料对MSCs胶原合成的影响.[结果]8 h后MSCs在支架材料上呈球型黏附生长,4 d后MSCs在支架材料上呈菱形或多角型复层生长,包裹于大量细胞外基质内.GDABM组细胞第3 d进入对数增长期,倍增时间为4.75 d,而单纯软骨细胞培养对照组倍增时间为5.25 d.GDABM组与单纯软骨细胞培养对照组比较胶原合成略低,3H-Proline掺入值有显著性差异(P＜0.05),说明经诱导MSCs的细胞胶原分泌功能仍低于软骨细胞.[结论]经TGF-β诱导和低转速离心应力刺激后的MSCs向软骨细胞功能分化,复合细胞因子梯度降解软骨支架材料具有良好的生物相容性,可作为MSCs的有效载体应用于组织工程化软骨的构建.
